surgoncoКреативная хирургия и онкологияCreative surgery and oncology2076-30932307-0501Башкирский государственный медицинский университет10.24060/2076-3093-2019-9-1-80-86surgonco-367Research ArticleЛАБОРАТОРНЫЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯLABORATORY AND EXPERIMENTAL INVESTIGATIONЭкстракция малых РНК из биологических жидкостей человека для последующего секвенирования нового поколенияExtracting Small RNAs from Human Biological Fluids for Subsequent Next-Generation Sequencinghttps://orcid.org/0000-0002-6149-5460БейлерлиО. А.BeylerliO. A.

Бейлерли Озал Арзуман оглы — аспирант кафедры урологии с курсом ИДПО 

450008, Уфа, ул. Ленина, 3

Beylerli Ozal Arzuman ogly — Post-graduate student of the Department of Urology with the Course of Additional Professional Education 

3 Lenin str., Ufa, 450008

obeylerli@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3486-6246БейлерлиА. Т.BeylerliA. T

Бейлерли Аферин Таги кызы — клинический ординатор 2-го года обучения кафедры акушерства и гинекологии № 1

450008, Уфа, ул. Ленина, 3

Beylerli Aferin Tagi kyzy — Resident of the Department of Obstetrics and Gynecology №1

3 Lenin str., Ufa, 450008

agamidli@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4965-0835ГареевИ. Ф.GaraevI. F.

Гареев Ильгиз Фанилевич — аспирант кафедры нейрохирургии и медицинской реабилитации с курсом ИДПО 

450008, Уфа, ул. Ленина, 3

Garaev Il’giz Fanilevich — Post-graduate student of the Department of Neurosurgery and Medical Rehabilitation with the Course of Additional Professional Education 

3 Lenin str., Ufa, 450008

ilgiz_gareev@mail.ruБашкирский государственный медицинский университетРоссияBashkir State Medical UniversityRussian Federation201925042019918086Copyright © Бейлерли О.А., Бейлерли А.Т., Гареев И.Ф., 20192019Бейлерли О.А., Бейлерли А.Т., Гареев И.Ф.Beylerli O.A., Beylerli A.T., Garaev I.F.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.surgonco.ru/jour/article/view/367

Существует ряд вопросов при выборе методик для экспериментов, связанных с секвенированием нового поколения (Next-Generation Sequencing). С одной стороны, во время работы с экстракцией РНК добавленные реагенты и их остатки часто могут ингибировать чувствительные химические вещества, с помощью которых осуществляется последовательный синтез для секвенирования. С другой, обработка данных с применением различного программного обеспечения для анализа результатов также может влиять на результаты секвенирования. Текущая работа будет описывать поэтапно, как готовятся образцы из биологических жидкостей человека для последующего секвенирования малых РНК, в частности некодирующих. Что касается способов экстракции или изоляции РНК, мы обнаружили, что малый выход РНК может быть значительно увеличен, по методу изоляции тотальной РНК и ее фракций, включенных в набор MirVana PARIS Kit от Ambion, при специальном подходе и модификации этапа органической экстракции. По сравнению с другими методиками поставляемые с имеющимися в продаже наборами на момент этой работы требуют только одной органической экстракции. Эта простая, но, как оказалось, весьма полезная модификация позволяет получить доступ к ранее недоступному материалу. Потенциальными преимуществами этой модификации являются более полное профилирование малых РНК, а также более широкий доступ к небольшим объемам образцов, как правило, доступ к биологическим жидкостям человека, которые могут быть приготовлены для секвенирования РНК на платформе Illumina.

A number of questions arise when choosing methods for experiments related to next-generation sequencing. On the one hand, while working with RNA extraction, added reagents and their residues can often inhibit sensitive chemicals with which the sequential synthesis is carried out for the sequencing. On the other hand, processing the same data using different software for the analysis can also impact on the sequencing results. This paper will present the step by step procedure for the preparation of samples taken from human biological fluids for subsequent sequencing of small RNAs, small noncoding RNAs in particular. Regarding the methods of extraction or isolation of RNAs, we found that low RNA yield can be improved significantly by following the isolation method for total RNA and its fractions included in Ambion’s MirVana PARIS kit, but only if using a special approach and modifying the organic extraction step. Compared to others, the methods supplied with commercially available kits at the time of researching this paper require only one organic extraction. This simple but, as it turned out, very useful modification makes it possible to access previously unavailable material. Potential advantages of this modification include a more complete profiling of small non-coding RNAs and a broader access to small sample volumes, as a rule, access to human biological fluids which can be prepared for RNA sequencing on the Illumina platform.

экстракция РНКмалые РНКсеквенирование нового поколенияцереброспинальная жидкостьбиологические жидкостиRNA extractionsmall RNAnext-generation sequencingcerebrospinal fluidbiological fluidsReferencesBaudhuin L.M. Quality guidelines for next-generation sequencing. Clin Chem 2013;59:858–9. DOI: 10.1373/clinchem.2013.203091Baudhuin L.M. Quality guidelines for next-generation sequencing. Clin Chem 2013;59:858–9. DOI: 10.1373/clinchem.2013.203091Castel S.E., Martienssen R.A. RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond. Nature. 2013;14:100–12. DOI: 10.1038/nrg3355Castel S.E., Martienssen R.A. RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond. Nature. 2013;14:100–12. DOI: 10.1038/nrg3355Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998;(391):806–11. DOI: 10.1038/35888Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998;(391):806–11. DOI: 10.1038/35888O`Brien J., Hayder H., Zayed Y., Chun Peng. Overview of MicroRNA biogenesis, mechanisms of actions, and circulation. Front Endocrinol (Lausanne). 2018;9:402. DOI: 10.3389/fendo.2018.00402O`Brien J., Hayder H., Zayed Y., Chun Peng. Overview of MicroRNA biogenesis, mechanisms of actions, and circulation. Front Endocrinol (Lausanne). 2018;9:402. DOI: 10.3389/fendo.2018.00402Wang H., Zhong J., Chai Z., Zhu J., Xin J. Comparative expression profile of microRNAs and piRNAs in three ruminant species testes using next-generation sequencing. Reprod Domest Anim. 2018;53(4):963– 70. DOI: 10.1111/rda.13195Wang H., Zhong J., Chai Z., Zhu J., Xin J. Comparative expression profile of microRNAs and piRNAs in three ruminant species testes using next-generation sequencing. Reprod Domest Anim. 2018;53(4):963– 70. DOI: 10.1111/rda.13195Schee K., Lorenz S., Worren M.M., Günther C.C., Holden M., Hovig E. et al. Deep sequencing the microRNA transcriptome in colorectal cancer. PLoS One. 2013;8:e66165. DOI: 10.1371/journal.pone.0066165Schee K., Lorenz S., Worren M.M., Günther C.C., Holden M., Hovig E. et al. Deep sequencing the microRNA transcriptome in colorectal cancer. PLoS One. 2013;8:e66165. DOI: 10.1371/journal.pone.0066165Chana G., Bousman C.A., Money T.T., Gibbons A., Gillett P., Dean B. et al. Biomarker investigations related to pathophysiological pathways in schizophrenia and psychosis. Front Cell Neurosci. 2013;7:95. DOI: 10.3389/fncel.2013.00095Chana G., Bousman C.A., Money T.T., Gibbons A., Gillett P., Dean B. et al. Biomarker investigations related to pathophysiological pathways in schizophrenia and psychosis. Front Cell Neurosci. 2013;7:95. DOI: 10.3389/fncel.2013.00095Liu L., Wang J., Khanabdali R., Kalionis B., Tai X., Xia S. Circular RNAs: Isolation, characterization and their potential role in diseases. RNA Biol. 2017;14(12):1715–21. DOI: 10.1080/15476286.2017.1367886Liu L., Wang J., Khanabdali R., Kalionis B., Tai X., Xia S. Circular RNAs: Isolation, characterization and their potential role in diseases. RNA Biol. 2017;14(12):1715–21. DOI: 10.1080/15476286.2017.1367886Lekchnov E.A., Zaporozhchenko I.A., Morozkin E.S., Bryzgunova O.E., Vlassov V.V., Laktionov P.P. Protocol for miRNA isolation from biofluids. Anal Biochem. 2016;499:78–84. DOI: 10.1016/j.ab.2016.01.025Lekchnov E.A., Zaporozhchenko I.A., Morozkin E.S., Bryzgunova O.E., Vlassov V.V., Laktionov P.P. Protocol for miRNA isolation from biofluids. Anal Biochem. 2016;499:78–84. DOI: 10.1016/j.ab.2016.01.025Burgos K.L., Javaherian A., Bomprezzi R., Ghaffari L., Rhodes S., Courtright A. et al. Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing. RNA. 2013;5:712–22. DOI: 10.1261/rna.036863.112Burgos K.L., Javaherian A., Bomprezzi R., Ghaffari L., Rhodes S., Courtright A. et al. Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing. RNA. 2013;5:712–22. DOI: 10.1261/rna.036863.112Sun Z., Shi K., Yang S., Liu J., Zhou Q., Wang G. et al. Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications. Mol Cancer. 2018;17(1):147. DOI: 10.1186/s12943-018-0897-7Sun Z., Shi K., Yang S., Liu J., Zhou Q., Wang G. et al. Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications. Mol Cancer. 2018;17(1):147. DOI: 10.1186/s12943-018-0897-7Anfossi S., Babayan A., Pantel K., Calin G.A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs — an update. Nat Rev Clin Oncol. 2018;15(9):541–63. DOI: 10.1038/s41571-018-0035-xAnfossi S., Babayan A., Pantel K., Calin G.A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs — an update. Nat Rev Clin Oncol. 2018;15(9):541–63. DOI: 10.1038/s41571-018-0035-xAmini P., Ettlin J., Opitz L., lementi E., Malbon A., Markkanen E. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. Mol Biol. 2017;18(1):22. DOI: 10.1186/s12867-017-0099-7Amini P., Ettlin J., Opitz L., lementi E., Malbon A., Markkanen E. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. Mol Biol. 2017;18(1):22. DOI: 10.1186/s12867-017-0099-7Majem B., Li F., Sun J., Wong D.T. RNA sequencing analysis of salivary extracellular RNA. Methods Mol Biol. 2017;1537:17–36. DOI: 10.1007/978-1-4939-6685-1_2Majem B., Li F., Sun J., Wong D.T. RNA sequencing analysis of salivary extracellular RNA. Methods Mol Biol. 2017;1537:17–36. DOI: 10.1007/978-1-4939-6685-1_2Gautam A., Kumar R., Dimitrov G., Hoke A., Hammamieh R., Jett M. Identifi ation of extracellular miRNA in archived serum samples by nextgeneration sequencing from RNA extracted using multiple methods. Mol Biol Rep. 2016;43(10):1165–78. DOI: 10.1007/s11033-016-4043-6Gautam A., Kumar R., Dimitrov G., Hoke A., Hammamieh R., Jett M. Identifi ation of extracellular miRNA in archived serum samples by nextgeneration sequencing from RNA extracted using multiple methods. Mol Biol Rep. 2016;43(10):1165–78. DOI: 10.1007/s11033-016-4043-6Acosta A.M., Al Rasheed M.R.H., Pins M.R., Borgen K.R., Panchal D., Rogozinska M. et al. The role of next-generation sequencing in the differential diagnosis of composite neoplasms. Hum Pathol. 2018;81:7888. DOI: 10.1016/j.humpath.2018.06.022Acosta A.M., Al Rasheed M.R.H., Pins M.R., Borgen K.R., Panchal D., Rogozinska M. et al. The role of next-generation sequencing in the differential diagnosis of composite neoplasms. Hum Pathol. 2018;81:7888. DOI: 10.1016/j.humpath.2018.06.022

The authors declare that there are no conflicts of interest present.