Внеклеточные везикулы (ВВ) — это мембранные частицы, которые представляют собой гетерогенную популяцию по размеру (диаметр от 30 нм до 5 мкм) и происхождению (экзосомы, микровезикулы (МВ), эктосомы или апоптотические тела), играя ключевую роль как в физиологических, так и в патологических процессах. За последние два десятилетия область исследований, связанная с ВВ, экспоненциально выросла, что демонстрирует ее значимость [1]. Эти высокогетерогенные ВВ высвобождаются почти всеми типами клеток и содержат множество биомолекул, таких как белки, РНК, некодирующие РНК (нкРНК), ДНК, шапероны и липиды [2–4]. Состав ВВ варьируется в зависимости от физиологических и патологических состояний, что делает их привлекательными в качестве биомаркеров. ВВ в большом количестве присутствуют в биологических жидкостях, главным образом в крови, моче и слюне. Поэтому анализ ВВ в биологических жидкостях был предложен в качестве неинвазивного/малоинвазивного метода для идентификации новых биомаркеров многих заболеваний, в том числе опухоли [5–9].

ВВ также являются перспективными носителями лекарственных средств благодаря своей биосовместимости и способности преодолевать биологические барьеры, такие как гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) [10–12]. Ранее ВВ считались клеточными отходами, пока исследования не показали, что ВВ служат средством межклеточной коммуникации, доставляя биологический груз к соседним и отдаленным участкам организма. С тех пор ВВ активно изучаются в патофизиологических условиях, а также в целях разработки терапевтических и диагностических средств [13]. Например, участие микроРНК во многих биологических процессах хорошо задокументировано, включая пролиферацию клеток, клеточную дифференциацию, миграцию клеток, инициацию и прогрессирование заболеваний (рис. 1) [14][15].

Потенциальная роль микроРНК в коммуникации между клетками и тканями убедительно подтверждается тем фактом, что микроРНК могут экспортироваться и импортироваться клетками посредством механизмов, включающих везикулярный транспорт. Передача информации через ВВ считается одним из важных способов межклеточной коммуникации, столь же важным, как и передача сигналов, зависящая от контакта между клетками, и передача сигналов посредством переноса растворимых молекул. Однако малый размер и многоуровневая гетерогенность ВВ затрудняют изучение их биологических свойств с использованием подходящих методов визуализации. Для облегчения этих исследований было разработано множество методов маркировки и свойств ВВ. Каждая стратегия визуализации имеет свои преимущества и недостатки. В данной работе представлен обзор происхождения и классификации ВВ, а также освещены различные методы визуализации, используемые на этапах их происхождения, выделения, динамического поглощения и высвобождения ВВ из клеток. Обсуждаются преимущества и ограничения различных методов визуализации, чтобы предоставить исследователям лучшее понимание наиболее подходящего метода для их конкретного применения.

В 2018 году Международное общество по внеклеточным везикулам (International Society for Extracellular Vesicles, ISEV) обновило рекомендации, выпущенные еще в 2014 году, сосредоточив внимание на необходимости надлежащей номенклатуры при описании ВВ для стандартизации протоколов и отчетов в этой области. В рекомендациях 2018 года по исследованиям ВВ «Минимальный объем информации для исследований внеклеточных везикул»» (Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018; MISEV2018) термин «ВВ» был рекомендован как наилучшая общая терминология для частицы, состоящей из липидного бислоя, высвобождаемой клетками. «ВВ» считается собирательным термином, охватывающим различные подтипы высвобождаемых клетками мембранных структур, включая экзосомы, МВ (ранее также известные как микрочастицы), эктосомы, онкосомы, апоптотические тельца и другие, независимо от механизма их биогенеза, высвобождения, молекулярных маркеров, размера, плотности и функции. Инициатива MISEV2018 стандартизирует терминологию, сбор и предварительную обработку образцов, разделение и концентрирование ВВ, их характеристику, функциональные исследования, а также требования к отчетности и исключения из нее [16–20]. ВВ включают в себя различные типы везикул, где состав содержимого ВВ отражает характеристики родительской клетки (рис. 2). По этой причине ВВ, высвобождаемые опухолевыми клетками, могут использоваться в качестве биомаркеров онкологических заболеваний. Для расширения области применения ВВ ряд исследований было посвящено их потенциалу в качестве биомаркеров старения и возрастных заболеваний. Более того, поверхность ВВ имеет специфический набор рецепторов, определяющих их целевую клетку. Таким образом, ВВ имеют специфическую родительскую клетку и специфическую целевую клетку. Эта особенность делает их очень полезными в терапевтических целях и в качестве средств доставки лекарств.

Экзосомы относительно малы по размеру, от 30 до 150 нм, и процесс их образования сложен. Первоначально клеточная мембрана вдавливается внутрь, образуя ранние эндосомы, которые позже созревают в мультивезикулярные тела. Эти тела затем могут сливаться либо с лизосомами, либо с плазматической мембраной, образуя экзосомы [21][22]. Однако механизм коммуникации, обмена материалами и сортировки между различными внутриклеточными органеллами и эндосомами во время образования экзосом до сих пор полностью не изучен, что приводит к различиям в содержании экзосом из одного и того же клеточного источника [23][24]. МВ, с другой стороны, образуются путем прямого отпочковывания от плазматической мембраны клетки и имеют больший размер, от 100 до 1000 нм [25]. Помимо МВ, были идентифицированы и другие ВВ, происходящие из плазматической мембраны и имеющие различную форму, такие как миграционные тельца и везикулы, происходящие из микроворсинок [23–26]. Эти подтипы ВВ обладают схожими биофизическими характеристиками, включая размер, плотность, содержимое и состав мембраны [27]. Однако механизм поглощения и слияния различных подтипов ВВ остается неясным. Кроме того, происхождение, передача, поглощение и другие механизмы процессов ВВ до сих пор неизвестны. Поэтому для исследования и изучения биологических процессов ВВ необходимы передовые и надежные методы выделения (изоляция) и визуализации (табл. 1) [21–27].

К числу распространенных методов выделения ВВ относятся ультрацентрифугирование, ультрацентрифугирование в градиенте плотности, фильтрация, а также методы, основанные на изменениях растворимости и/или агрегации ВВ, эксклюзионная хроматография и осаждение с использованием полимеров (рис. 3) [28].

С 2015 года во всем мире предпринимаются многочисленные усилия по разработке и совершенствованию методов количественного определения и характеристики ВВ [29][30]. В отсутствие одного оптимизированного и подходящего подхода необходимо использовать как минимум две разные методики для количественного определения и/или характеристики морфологии, биокомпозиции и рецепторов ВВ. Выбранные методы выделения, количественного определения и характеристики ВВ могут влиять на интерпретацию результатов. Поэтому крайне важно унифицировать их, чтобы обеспечить возможность сравнения исследований, проведенных разными группами ученых. Например, исследователям необходимо стандартизировать методы выделения и количественного определения ВВ. ВВ можно выделять из биологических жидкостей, таких как плазма и моча, но их также можно получать из клеток, культивируемых in vitro. В обоих случаях множество различных методов выделения и характеристики ВВ могут приводить к различиям в количестве, выходе, степени извлечения и функциях ВВ.

ВВ и их взаимодействие с клетками-реципиентами представляют собой быстро развивающуюся область исследований. Однако из-за ограничений существующих методологий механизмы этих взаимодействий до сих пор остаются неясными. Микроскопические исследования ВВ представляют собой сложную задачу, поскольку их типичный диаметр близок к пределу разрешения световой микроскопии, а электронная микроскопия имеет ограниченные возможности для мечения белков.

В последнее время появилось множество методов, позволяющих продемонстрировать поглощение ВВ клетками-реципиентами. К таким методам относятся добавление ВВ с субстратом люциферина для взаимодействия с клетками, экспрессирующими люциферазу, или использование РНК-интерференции, опосредованной ВВ, для подавления экспрессии генов в качестве доказательства того, что поглощение ВВ происходило путем слияния с плазматической мембраной или через пути после интернализации с эндосомальной мембраной [31]. Наиболее распространенным методом является мечение ВВ флуоресцентным красителем липидной мембраны и их визуализация с помощью конфокального микроскопа, поскольку это позволяет отслеживать все подтипы ВВ [32].

Однако использование липофильных красителей имеет некоторые ограничения, поскольку у этих красителей длительный период полураспада и они могут неточно отражать период полураспада ВВ. В результате флуоресцентные молекулы липофильных красителей переносятся с внеклеточных везикул на клеточные мембраны, создавая псевдокартину пространственно-временной оценки внеклеточных везикул, которая в действительности обусловлена обычной рециркуляцией мембран. Еще одним недостатком методов флуоресцентной маркировки является почти предел разрешения светового микроскопа, что позволяет визуализировать ВВ с относительно низким разрешением [33]. Кроме того, использование широкопольных методов не дает достоверной картины детальной субклеточной локализации сигнала.

В последнее время для получения более подробных данных о биологии ВВ используются передовые методы электронной микроскопии, такие как иммуноэлектронная микроскопия и криосекционирование [34][35]. Корреляционная световая и электронная микроскопия (КЛЭМ) — это метод, сочетающий оптическую и электронную микроскопию, позволяющий получать изображения высокого разрешения той же структуры, которая наблюдается с помощью флуоресцентных методов. В то время как световая микроскопия обеспечивает эффективную маркировку и локализацию белков, электронная микроскопия показывает ультраструктурные детали интересующих клеточных структур [36]. Клетки, наблюдаемые с помощью световой микроскопии высокого разрешения, коррелируются с электронной микроскопией нанометрового разрешения, которая предоставляет подробные данные о субклеточной локализации и морфологии ВВ и позволяет точно обнаруживать отдельные везикулы.

Электронная микроскопия за последние 100 лет стала революционной технологией визуализации для ученых и инженеров, открыв мир наноматериалов и позволив характеризовать их уникальные свойства. Возможность электронных микроскопов получать изображения объектов субмикронного размера, вплоть до отдельных атомов, привела к разработке совершенно новых нанотехнологий, а также позволила добиться замечательных результатов в наноинженерии макроскопических компонентов. Электронная микроскопия — это сложная, зрелая технология и включает в себя множество направлений и методологий. Сегодня наиболее распространенным в мире микроскопом является световой микроскоп. Световые микроскопы дешевы, надежны и, как правило, неинвазивны, оставляя изображаемый объект неизменным в процессе получения изображения. Существует множество вариантов световой микроскопии, но обычно есть предел их способности различать объекты и особенности размером менее 100 нм [37][38].

Использование светового микроскопа позволяет получать изображения ВВ в диапазоне размеров от примерно 30 нм до 1 мкм, используя взаимодействие освещения с наночастицами. Визуализация ВВ обычно основана на методах рассеяния/фазового контраста без использования меток (темное поле и фазовый контраст) или на флуоресцентной маркировке (липидные красители или антитела) для обеспечения специфичности. Световой путь включает в себя освещение, взаимодействие с образцом и детектирование объективом, линзой тубуса и камерой (рис. 4) [39].

Как правило, отдельные экзосомы невозможно увидеть с помощью стандартного светового микроскопа. Их размер составляет 30–100 нм, что значительно меньше дифракционного предела света. Однако их можно визуализировать с помощью световой микроскопии, если их пометить и получить изображение в виде флуоресцентных сигналов, или визуализировать их поглощение клетками. Для непосредственной визуализации фактической структуры экзосом наиболее предпочтительным методом является электронная микроскопия [40].

Размер многих ВВ из биологических жидкостей ниже разрешения даже самых современных оптических микроскопов. Поэтому для оценки их морфологии используется электронная микроскопия. В целом, существует два типа электронных микроскопов: сканирующие электронные микроскопы (СЭМ) и просвечивающие, или трансмиссионные, электронные микроскопы (ТЭМ) [32]. Оба работают путем облучения образца пучком электронов в условиях высокого вакуума (10⁻⁴–10⁻⁵ Па) и используют взаимодействие этих электронов с атомами образца для создания изображения. Таким образом, оба микроскопа состоят из трех основных компонентов: 1) электронной пушки, которая генерирует электронный пучок; 2) магнитных линз и апертур в металлических диафрагмах для формирования электронного пучка и направления его к образцу или детектору и 3) детекторов, которые собирают сигналы, возникающие в результате взаимодействия электронного пучка с образцом, и преобразуют их в изображение или график (табл. 2) [41–43].

В сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) электронный пучок фокусируется в точку и последовательно сканирует образец. В каждой точке из образца испускаются сигналы, которые затем собираются детекторами. Сигнал детектора синхронизируется с известным местоположением пучка на образце, а интенсивность сигнала используется для модуляции соответствующего пикселя изображения. Сигналы, собранные последовательно, объединяются для формирования изображения, размеры/распределение пикселей которого зависят от выбранной схемы сканирования. Типичная энергия электронов составляет 1–30 кэВ (рис. 5) [44].

Для биологических образцов, таких как ВВ, наиболее актуальны детекторы вторичных электронов. Они регистрируют низкоэнергетические электроны, испускаемые только вблизи поверхности образца, и могут предоставить ценную информацию об образце (морфология и состав, текстура поверхности и шероховатость). Для визуализации ВВ с помощью СЭМ, которые являются непроводящими, их необходимо покрыть тонкой металлической пленкой для рассеивания электронов. В целом СЭМ является эффективным методом наблюдения за внешним видом ВВ. Однако внешняя форма ВВ деформируется при их прикреплении к поверхности, и трудно различить разные частицы. Металлическое покрытие также затрудняет наблюдение за внутренней частью фосфолипидного бислоя [45][46].

В ТЭМ электронный пучок падает на определенную область образца. Электроны, прошедшие через образец, фокусируются линзами и собираются параллельным детектором для формирования изображения. Энергия электронов в ТЭМ значительно выше, чем в СЭМ, обычно 80–300 кэВ, что позволяет им проникать сквозь материал (рис. 6) [47].

ТЭМ — наиболее распространенный тип электронной микроскопии для визуализации ВВ, используемый в основном для контроля качества и чистоты образцов, содержащих ВВ, поскольку позволяет лучше различать отдельные ВВ от частиц аналогичного размера, не являющихся ВВ. Специфическое распознавание ВВ может быть дополнительно усилено путем присоединения иммунометок, например электронно-непроницаемых золотых наночастиц (диаметром от 1 до 20 нм), функционализированных специфическим антителом, к антигенным участкам на ВВ. Это приводит к так называемой иммуно-ТЭМ-визуализации, которая позволяет функционально изучать структуру и наблюдать положение специфических белков [48]. Главный недостаток использования иммуномечения с обычной ТЭМ заключается в том, что образец может быть значительно изменен в процессе необходимой подготовки для его иммобилизации и высушивания. С другой стороны, вместо высушивания биологические образцы могут быть полностью затвердевшими путем замораживания при очень низких температурах во время визуализации (77 К) [49]. Таким образом, ВВ можно наблюдать в гидратированном состоянии даже при высоком вакууме. Этот метод электронной микроскопии называется криоТЭМ и является мощным инструментом для оценки морфологии внеклеточных везикул [50]. Он сохраняет нативную структуру биологического материала и позволяет избежать изменений или модификаций, обычно встречающихся в традиционных методах электронной микроскопии.

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) — это инструмент для определения морфологии, структуры и состава, а также биомеханических и биофизических характеристик нанометровых структур. Вкратце: АСМ использует микрометровый кантилевер с нанометровым наконечником, приводимым в движение пьезоэлектрическими кристаллами [51]. При получении сигналов о взаимодействии наконечника с образцом позиционно-чувствительный фотодиод преобразует их в напряжение и передает на пьезоэлектрический актуатор (ПА) [52]. Последний расширяется и сжимается пропорционально приложенному напряжению, позволяя с высокой точностью манипулировать образцом и положением зонда в трех измерениях. ПА может быть соединен с кантилевером или расположен под держателем образца. Вся система регулируется соответствующей управляющей электроникой. В отличие от электронной микроскопии, которая работает только в вакууме и, следовательно, влияет на морфологию поверхности, АСМ может работать в нормальных условиях и в двух средах: воздухе или жидкости [53]. Воздушная среда подразумевает сушку образца в слабом потоке азота, и было показано, что анализируемые на воздухе ВВ сжимаются и приобретают характерную чашеобразную форму в процессе испарения из-за сжатия центральной более мягкой области относительно окружающих частей. Напротив, жидкая среда чаще всего ближе к физиологическим условиям, в которых находятся ВВ, чем осушённые или поверхностно модифицированные образцы. В растворе сохраняется более естественные структуры и динамика ВВ, и не требуется наносить покрытия, что уменьшает риск искажений в размере, составе поверхностной мантии и межчастичных взаимодействий. Это особенно полезно для мониторинга в реальном времени и для аналитических техник, работающих в жидкой фазе. Это лучше сохраняет сферическую форму ВВ, но усложняет оптимизацию положения лазера и снижение шума. Следовательно, визуализация на воздухе полезна при проверке наличия везикул и качества образца. Однако визуализация в жидкости является оптимальным выбором, поскольку она сохраняет свойства ВВ и отражает их естественное состояние [54–56]. Определить исключительное влияние среды на форму наночастиц сложно, это скорее сложная комбинация факторов, таких как различные силы, подложка, используемая для прикрепления образца, и протоколы подготовки образца.

АОН — это универсальный метод, позволяющий анализировать концентрацию, размер и субпопуляции биомаркеров посредством селективной флуоресцентной маркировки. Подобно динамическому рассеянию света, АОН оценивает размер ВВ по их броуновскому движению в среде [57]. Однако эти два метода различаются по подходу к анализу. АОН — это подход «снизу вверх», который отслеживает диффузию отдельных частиц и обобщает данные по отдельным частицам на целые группы, тогда как динамическое рассеяние света — это метод ансамблевого анализа «сверху вниз», который наблюдает флуктуационные сигналы целых частиц и анализирует автокорреляционные функции [58]. В АОН рассеянный сигнал отдельных частиц регистрируется в соответствии с временным интервалом каждого кадра, а затем сигналы связываются с помощью алгоритма ближайшего соседа. Анализ отслеживания динамических одиночных ВВ зависит от полученных изображений. Поэтому наиболее важным фактором для повышения точности отслеживания является получение четкого сигнала от частиц с высоким отношением сигнал/шум. Свет от ВВ рассеивается в области рэлеевского рассеяния, и интенсивность пропорциональна шестой степени диаметра. Измеренный размер частиц для АОН варьируется от 50 нм до 1 мкм [59][60]. Для точной визуализации и анализа необходимо подготовить частицы относительно однородного и подходящего размера, чтобы избежать помех от других сигналов из-за исключительно сильного рассеянного света крупных или агрегированных частиц. Кроме того, образцы с чрезмерно высокой концентрацией приводят к тому, что обнаруженные частицы не совпадают с сигналами от других частиц вокруг них, что создает проблемы для анализа отслеживания, требующего связывания частиц на нескольких кадрах [61]. Для получения высокого отношении сигнал/шум в коммерческой технологии АОН используется сильнонаклонное тонкое освещение для падающего луча, чтобы минимизировать разницу между толщиной лазера и глубиной резкости и уменьшить внефокусный шум [62].

Внеклеточные везикулы — это наноносители в организме, которые выступают в качестве медиаторов межклеточной коммуникации и прогрессирования ряда заболеваний, в том числе онкологических. С момента первого открытия ВВ особенно известны своим потенциалом в доставке лекарств и клинической диагностике. ВВ не только имеют различные компоненты в зависимости от клеточной линии, но и обладают гетерогенными характеристиками в популяции ВВ, полученных из одной и той же клеточной линии. Они по своей природе сложны, учитывая разнообразие выполняемых ими функций. Поэтому необходимо различать эти гетерогенные ВВ и выявлять их роли.

Методы электронной микроскопии, АСМ или АОН, являются мощными инструментами для визуализации ВВ. Однако как сами ВВ, так и аспекты, связанные с микроскопией, могут существенно влиять на конечные результаты визуализации и, следовательно, требуют детальной и целенаправленной оптимизации. С одной стороны, существует среда, содержащая ВВ, которые необходимо визуализировать. Среда может представлять собой либо биологическую жидкость, либо буфер после выделения ВВ. Каждый тип среды, содержащей ВВ, может иметь специфическую кислотность, солевой состав и концентрацию, которые могут существенно влиять на последующую процедуру подготовки образцов для микроскопических методов. С другой стороны, протоколы и методы подготовки образцов для существующих методов одинаково возможны в бесчисленных вариантах и не стандартизированы, что делает микроскопическую характеристику ВВ вариабельной и ненадежной. Эта вариабельность обусловлена несколькими факторами, и для описания вариаций формы, морфологии, структуры и топографии ВВ используется различная терминология. Особое внимание следует уделить этапам протоколов подготовки образцов и контролю образования артефактов. Наряду со стандартным применением электронной микроскопии и атомно-силовой микроскопии для выявления наличия структур, подобных внеклеточным везикулам, и примесей следует внедрить подход, основанный на иммунодетекции отдельных внеклеточных везикул, чтобы снизить уровень неопределенности. Источники вариации следует оценивать до проведения каких-либо последующих анализов, чтобы предотвратить неверные интерпретации в ходе исследований биологических функций ВВ.