Глиомы являются наиболее распространенными первичными злокачественными опухолями головного мозга в мире. Согласно современной классификации опухолей центральной нервной системы (ЦНС) ВОЗ 2021, диффузные глиомы взрослого типа подразделяются на: астроцитому с мутацией фермента изоцитратдегидрогеназы (IDH) (Grade 2, 3 или 4), олигодендроглиому с мутацией IDH и коделецией 1p/19q (Grade 2 или 3) и глиобластому с диким типом IDH (Grade 4). Злокачественные глиомы (Grade 3 и 4) связаны с плохим прогнозом, несмотря на улучшенное понимание внутренних факторов прогрессирования заболевания [1]. Комбинированная терапия, включающая хирургическое удаление с применением темозоломида (TMZ) в сочетании с облучением головного мозга, как было показано, значительно увеличивают общую выживаемость, однако рецидивы наблюдаются почти у всех пациентов, и лишь немногие живут дольше 2 лет. Более того, диагностика и оценка прогноза глиом в основном основаны на методах нейровизуализации [2]. Однако нейровизуализация не может в полной мере использоваться в качестве основы для диагностики и оценки прогноза из-за инфильтративного характера роста глиом, в частности злокачественных глиом. Поэтому открытие и идентификация новых биомаркеров особенно важны для диагностики, мониторинга терапии и оценки прогноза.

Прогрессирование диффузных глиом взрослого типа обусловлено скоординированной дерегуляцией множества биологических процессов, включая аберрантную передачу сигналов рецепторных тирозинкиназ, эпигенетическое ремоделирование, взаимодействие с внеклеточным матриксом, метаболическое перепрограммирование и поддержание стволовости [3]. Поскольку эти механизмы функционируют совместно, а не независимо, одновременная оценка биомаркеров, представляющих различные молекулярные пути, может обеспечить более полное понимание биологии глиом, чем анализ, сфокусированный на одном гене/белке. Среди таких молекулярных кандидатов особенно привлекательны рецепторная тирозинкиназа ErbB3 (ERBB3), RE1-сайленсинг-транскрипционный фактор (REST), рецептор 1 с дискоидиновым доменом (DDR1), ацетил-КоА-синтетаза короткоцепочечных жирных кислот 2 (ACSS2) и дигидрооротатдегидрогеназа (DHODH), поскольку они в совокупности представляют собой основные признаки прогрессирования диффузных глиом взрослого типа.

ERBB3, REST, DDR1, ACSS2 и DHODH представляют собой пять биологически взаимодополняющих молекул, которые в совокупности охватывают несколько фундаментальных признаков прогрессирования глиом. ERBB3 регулирует передачу сигналов онкогенных рецепторов посредством активации путей фосфатидилинозитол-3-киназный/протеинкиназа B (PI3K/AKT) и митоген-активируемый протеинкиназный путь (MAPK), тем самым способствуя пролиферации, выживанию и резистентности опухолевых клеток к терапии [4][5]. REST функционирует как главный транскрипционный регулятор, поддерживающий свойства стволовых клеток глиомы, подавляющий нейрональную дифференцировку и способствующий эпигенетическому перепрограммированию [6][7]. DDR1 опосредует взаимодействие между опухолевыми клетками и внеклеточным матриксом, облегчая миграцию клеток, инвазию и инфильтративный рост [8][9]. В отличие от них, ACSS2 и DHODH являются центральными метаболическими ферментами, которые позволяют клеткам глиом адаптироваться к гипоксии и дефициту питательных веществ, регулируя использование ацетата и синтез пиримидинов de novo соответственно [10–14]. Вместе эти белки интегрируют передачу сигналов, стволовые свойства, инвазию и метаболическую адаптацию, представляя собой взаимодополняющие механизмы, лежащие в основе злокачественности диффузных глиом взрослого типа.

Несмотря на существенные успехи в изучении глиом, многие потенциально значимые биомаркеры, включая ERBB3, REST, DDR1, ACSS2 и DHODH, остаются недостаточно изученными. Их биологические функции, паттерны экспрессии и клиническое значение в прогрессировании глиомы и прогнозе для пациентов еще не были всесторонне изучены. В этом контексте общедоступные мультимодальные базы данных предоставляют эффективную и экономически выгодную стратегию для первоначальной идентификации и приоритизации новых потенциальных биомаркеров. Комплексный анализ данных «Атласа белков человека (HPA)» с использованием методов биоинформационного анализа может обеспечить объективную количественную оценку экспрессии этих белков, вы­явить ранее неизвестные закономерности их распределения в опухолевой ткани и определить наиболее перспективные биомаркеры для последующей экспериментальной и клинической валидации [15].

Главное преимущество базы данных заключается в том, что изображения предоставляют информацию об экспрессии, пространственном распределении и локализации каждого белка в различных тканях. Таким образом, база данных HPA может обеспечить лучшую пространственную локализацию экспрессии белка, чем любой другой ресурс. Она предоставляет информацию о паттернах экспрессии белка в отдельных типах и подтипах клеток, локализации внутри клеток, тканей и внеклеточного матрикса и, таким образом, создает базу данных таких характеристик экспрессии биомаркеров [16]. Эта информация особенно важна для опухолевых тканей, поскольку клеточная пластичность и изменения в микроокружении опухоли становятся ключевыми факторами в патогенезе, прогрессировании и инвазивности рака. Эти характеристики тканей демонстрируют значимые связи с большинством канонических признаков опухоли. HPA можно рассматривать как инструмент для генерации гипотез, как дополнение к другим данным экспрессии, полученным методом высокопроизводительного анализа, и как основу для экспериментальных подходов. Цель исследования — провести анализ данных базы HPA с транскриптомной валидацией на основе базы данных TCGA для оценки экспрессии белков ERBB3, REST, DDR1, ACSS2 и DHODH и определения их потенциала в качестве новых значимых биомаркеров диффузных глиом взрослого типа.

Для оценки экспрессии, тканевого распределения и субклеточной локализации белков ERBB3, REST, DDR1, ACSS2 и DHODH использовали открытую базу данных HPA (https://www.proteinatlas.org/). В настоящем исследовании полученные изображения HPA использовались для визуальной оценки пространственного распределения исследуемых белков и определения их потенциальной роли в качестве биомаркеров диффузных глиом взрослого типа. Возможность анализа пространственной локализации белков является одним из ключевых преимуществ HPA по сравнению с исключительно транскриптомными базами данных, поскольку позволяет оценивать не только уровень экспрессии, но и клеточный контекст экспрессируемого белка.

Был проведен анализ данных экспрессии матричной РНК (мРНК) генов ERBB3, REST, DDR1, ACSS2 и DHODH, кодирующих соответствующие белки, из базы данных TCGA (https://portal.gdc.cancer.gov/). В исследование были включены данные РНК-секвенирования пациентов с диффузными глиомами взрослого типа. Образцы были разделены в соответствии со степенью злокачественности опухоли: пациенты с глио­бластомой IDH — дикий тип Grade 4 (n = 153), пациенты с диффузными астроцитомами с мутацией IDH Grade 2 (n = 249) и пациенты с диффузными астроцитомами с мутацией IDH Grade 3 (n = 263). Были включены образцы здоровой мозговой ткани, которые были взяты за контрольную группу (n = 270).

Оценку иммуногистохимической экспрессии проводили с учетом интенсивности окрашивания, доли иммунопозитивных клеток и субклеточной локализации белков. Интенсивность ИГХ-окрашивания оценивали полуколичественным методом на основании выраженности специфического коричневого окрашивания, формируемого в результате взаимодействия антиген — антитело. Интенсивность окрашивания классифицировали по балльной шкале: а) 0 баллов (отрицательная реакция) — отсутствие специфического иммунного окрашивания в опухолевых клетках; б) 1 балл (слабая экспрессия) — слабое, едва различимое окрашивание с низкой интенсивностью сигнала; в) 2 балла (умеренная экспрессия) — выраженное специфическое окрашивание средней интенсивности; и г) 3 балла (сильная экспрессия) — интенсивное коричневое окрашивание с высокой плотностью иммунного сигнала. Для каждого образца анализировали не менее 5–10 репрезентативных полей зрения при одинаковом увеличении микроскопа. Интенсивность специфического иммунного окрашивания классифицировали как отрицательную, слабую, умеренную или высокую. Долю иммунопозитивных клеток определяли как процент клеток, демонстрирующих специфическое окрашивание, относительно общего числа клеток в анализируемом поле зрения. В зависимости от уровня экспрессии процент позитивных клеток подразделяли на следующие категории: <25 %, 25–75 % и >75 %. Дополнительно оценивали субклеточную локализацию иммунного сигнала, классифицируя ее как мембранную, цитоплазматическую, ядерную или смешанную.

Для определения субклеточной локализации белков использовали изображения иммунофлуоресцентного анализа (ИФА), представленные в базе данных HPA. Изображения ИФА были получены с использованием валидированных первичных антител к исследуемым белкам и флуоресцентно меченных вторичных антител. Для идентификации клеточных компартментов применяли стандартные органеллоспецифические маркеры, используемые в HPA, включая окрашивание ядер красителем 4’,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI). Анализировали преимущественную локализацию исследуемых белков в различных клеточных компартментах, включая плазматическую мембрану, цитоплазму, ядро и внутриклеточные органеллы. Полученные данные использовали для характеристики пространственного распределения белков и сопоставления их субклеточной локализации с предполагаемыми биологическими функциями в клеточной линии U-251MG.

В анализ включали изображения ИГХ- и ИФА-анализа, удовлетворяющие следующим критериям: высокое пространственное разрешение, отсутствие выраженных артефактов, достаточная визуализация тканевых структур и наличие полной области исследуемой ткани. Изображения с низким качеством, выраженными дефектами окрашивания, механическими повреждениями или неполной визуализацией тканей исключались из исследования. Перед анализом все изображения подвергались стандартизированной предварительной обработке, включавшей: приведение изображений к единому размеру, нормализацию яркости и контрастности, коррекцию цветового пространства, удаление фоновых артефактов и автоматическое выделение области интереса (ROI). Для повышения устойчивости алгоритмов применялась аугментация изображений, включавшая поворот, отражение, масштабирование и изменение яркости.

Статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения R (версия 4.4.0). Все количественные данные представлены в виде медианы и межквартильного размаха (IQR). Для сравнения уровня экспрессии исследуемых генов между группами пациентов с глиомами различной степени злокачественности и нормальной тканью головного мозга использовали непараметрический критерий Краскела — Уоллиса. При выявлении статистически значимых различий выполняли множественные попарные сравнения с использованием непараметрических критериев Данна с корректировкой значений p по методу Бенджамини — Хохберга для контроля частоты ложных открытий (FDR). Статистический анализ ИГХ-данных включал сравнение интенсивности окрашивания и уровня экспрессии белков между исследуемыми группами. Результаты иммунофлуоресцентного анализа использовали преимущественно для качественной оценки субклеточной локализации исследуемых белков. Результаты считались статистически значимыми при значениях: p < 0,05 (*), p < 0,01 (**), p < 0,001 (***) и p < 0,0001 (****).

На рисунке 1 представлена сравнительная оценка уровня экспрессии генов ERBB3, REST, DDR1, ACSS2 и DHODH среди пациентов с диффузными глиомами взрослого типа различной степени злокачественности и образцами нормальной ткани головного мозга. На панели А и Б видно, что наиболее высокий уровень экспрессии генов ERBB3 и REST наблюдался при глиобластоме, тогда как при диффузных астроцитомах Grade 2 и 3 и в контрольной группе отмечалось последовательное снижение экспрессии. На панелях В и Г представлен анализ экспрессии генов DDR1 и ACSS2, где установлено, что уровень экспрессии данных генов сохранялся повышенным во всех группах пациентов с глиомами по сравнению с контрольной группой. Однако в случае с геном ACSS2 часть сравнений между отдельными группами пациентов с глиомами не достигала статистической значимости, что может свидетельствовать о сохранении высокой активности данного метаболического пути независимо от степени опухолевой прогрессии. На панели Д показана экспрессия гена DHODH, где было выявлено значительное увеличение экспрессии гена DHODH в опухолевых образцах по сравнению с контрольными образцами. Наиболее высокий уровень экспрессии отмечался в группах пациентов со злокачественными глиомами Grade 3–4, тогда как группа c глиомами Grade 2 демонстрировала несколько сниженный уровень экспрессии, однако сохраняла статистически значимое отличие от контрольной группы. В целом представленные данные демонстрируют, что гены ERBB3, REST, DDR1, ACSS2 и DHODH характеризуются измененным профилем уровня экспрессии при диффузных глиомах взрослого по сравнению с контрольной группой. Наиболее выраженные изменения наблюдаются в группе пациентов с агрессивными опухолями G1 глиомами Grade 3–4, что указывает на потенциальное участие данных генов в регуляции процессов опухолевой прогрессии, клеточного метаболизма, миграции и адаптации опухолевых клеток. Полученные результаты позволяют рассматривать экспрессию белков ERBB3, REST, DDR1, ACSS2 и DHODH, определяемую методами ИГХ и ИФА, как перспективных кандидатов для дальнейшего изучения в качестве биомаркеров диффузных глиом взрослого типа.

ИГХ окрашивание продемонстрировало отчетливые различия в интенсивности и распределении экспрессии белков ERBB3, REST, DDR1, ACSS2 и DHODH в исследуемых опухолевых образцах и нормальной мозговой ткани (рис. 2–6). ИГХ-ана­лиз продемонстрировал постепенное увеличение иммунореактивности белков ERBB3, REST, DDR1, ACSS2 и DHODH в исследованных опухолевых образцах тканей. Распределение иммунореактивности данных белков было гетерогенным, с различиями в интенсивности окрашивания между отдельными клеточными областями. Положительный сигнал был преимущественно локализован внутри опухолевых клеток и имел в основном цитоплазматические и мембранные характеристики. Переход от слабого окрашивания на панели А (нормальная мозговая ткань) к более выраженному окрашиванию на панелях Б (диффузная астроцитома Grade 2), Г (диффузная астроцитома Grade 3) и Д (глиобластома Grade 4) указывает на общее увеличение экспрессии данных белков. Эти морфологические различия позволяют предположить, что экспрессия ERBB3, REST, DDR1, ACSS2 и DHODH может быть связана с прогрессированием опухоли. Наблюдаемая гетерогенность предполагает, что эти белки могут отражать различные молекулярные характеристики прогрессирования глиомы. В целом эти результаты подтверждают дифференциальную экспрессию белков ERBB3, REST, DDR1, ACSS2 и DHODH среди изученных групп опухолевых образцов и предоставляют морфологические доказательства для его дальнейшего количественного определения глиом.

Для уточнения внутриклеточного распределения белков ERBB3, REST, DDR1, ACSS2 и DHODH был выполнен анализ ИФА-изображений в клеточной линии глиобластомы U-251MG, представленных в базе данных HPA. Анализ показал, что каждый из исследуемых белков характеризуется специфическим паттерном субклеточной локализации, отражающим его функциональную роль в клетке (рис. 7). В целом результаты ИФА продемонстрировали, что исследуемые белки обладают различными паттернами субклеточной локализации, отражающими их функциональную специализацию. Мембранная локализация белков ERBB3 и DDR1 подтверждает их участие в рецептор-опо­средованной передаче сигнала, преимущественно ядерное распределение белка REST соответствует его роли транскрипционного регулятора, тогда как белки ACSS2 и DHODH характеризуются преимущественно цитоплазматической локализацией, связанной с выполнением метаболических функций. Полученные данные дополняют результаты транскриптомного и ИГХ-анализа, подтверждая потенциальную значимость белков ERBB3, REST, DDR1, ACSS2 и DHODH в патогенезе диффузных глиом взрослого типа.

В данном исследовании представлена всесторонняя оценка пяти потенциально значимых биомаркеров ERBB3, REST, DDR1, ACSS2 и DHODH в диффузных глиомах взрослого типа с использованием транскриптомных, ИГХ- и ИФА-данных, основанная на базе данных HPA. Ключевым выводом является то, что все пять генов демонстрировали измененную экспрессию в ткани глиом по сравнению с нормальной мозговой тканью, хотя уровень и характер этих изменений различались между отдельными генами и степенями злокачественности глиом. Важно отметить, что транскриптомные данные были подтверждены данными о пространственной экспрессии на белковом уровне, демонстрирующими, что белки ERBB3, REST, DDR1, ACSS2 и DHODH не только дифференциально экспрессируются, но и демонстрируют различные паттерны клеточной и субклеточной локализации. Этот комбинированный подход особенно актуален для изучения биологии глиомы, поскольку прогрессирование опухоли характеризуется значительной молекулярной и клеточной гетерогенностью, которую невозможно адекватно оценить только с помощью транскриптомных измерений [17][18].

Было выявлено, что белки ERBB3 и REST продемонстрировали особенно выраженные различия между группами опухолей. Уровень экспрессии их мРНК был самым высоким в глиобластоме и постепенно снижался в глиомах с более низкой степенью злокачественности и в нормальной ткани головного мозга. Эта закономерность предполагает потенциальную связь с агрессивным фенотипом опухоли. Известно, что ERBB3 участвует в рецептор-опосредованной передаче сигналов и может активировать онкогенные сигнальные пути PI3K/AKT и MAPK, которые регулируют пролиферацию, выживаемость опухолевых клеток и устойчивость к противоопухолевой терапии [19–21]. Более того, в соответствии с транскриптомными данными ИГХ-анализ продемонстрировал сильную цитоплазматическую/мембранную экспрессию белка ERBB3 в опухолевых тканях, при этом более 75 % опухолевых клеток показали положительное окрашивание.

Белок REST представляет собой отдельный класс потенциальных биомаркеров благодаря своей роли в качестве регулятора транскрипции [22][23]. Повышенный уровень экспрессии гена REST в глиобластоме может быть связан с поддержанием недифференцированного клеточного состояния и подавлением нейрональной дифференцировки [24]. Преимущественно ядерная локализация, наблюдаемая в ИФА-исследованиях клеточной линии глиобластомы U-251MG, согласуется с предполагаемой транскрипционной функцией самого белка. С другой стороны, белок DDR1 показал несколько иную картину. Уровень экспрессии мРНК данного гена был повышен во всех исследованных группах глиом по сравнению с нормальной тканью головного мозга, при этом различия в уровне экспрессии между отдельными степенями злокачественности были менее выраженными. Полученные данные позволяют предположить, что белок DDR1 может быть вовлечен в биологические процессы, характерные для различных стадий развития и прогрессирования глиом. Его преимущественно мембрано-ассоциированная и цитоплазматическая локализация согласуется с его ролью рецептора, участвующего во взаимодействиях между опухолевыми клетками и внеклеточным матриксом [25–27]. Таким образом, повышенная экспрессия белка DDR1 может быть связана с клеточной адгезией, миграцией, инвазией и инфильтративным ростом опухоли [28].

Белки ACSS2 и DHODH являются кандидатами, потенциально участвующими в метаболизме опухолевых клеток. Было получено, что уровень экспрессии гена ACSS2 был повышен в опухолевой ткани по сравнению с нормальной тканью головного мозга, хотя несколько сравнений между различными степенями злокачественности не были статистически значимыми. Наблюдаемые цитоплазматическая и ядерная локализации ACSS2 согласуются с его метаболическими и регуляторными функциями. Ген DHODH продемонстрировал повышенную экспрессию в опухолевой ткани, причем особенно высокий уровень экспрессии наблюдался в глиомах Grade 3–4. Поскольку белок DHODH участвует в синтезе пиримидинов de novo, его повышенная экспрессия может отражать метаболические потребности, связанные с высокопролиферативными клетками высокозлокачественных глиом [29][30]. Его преимущественно цитоплазматическая гранулярная локализация, наблюдаемая с помощью иммунофлуоресценции, дополнительно подтверждает его внутриклеточную метаболическую роль.

Результаты данного исследования подтверждают потенциал белков ERBB3, REST, DDR1, ACSS2 и DHODH в качестве биомаркеров диффузных глиом взрослого типа. Их дифференциальная экспрессия и различное клеточное расположение позволяют предположить, что они могут отражать взаимодополняющие механизмы прогрессирования опухоли. Интеграция HPA-изображений с транскриптомными данными TCGA обеспечивает полезную основу для приоритизации биомаркеров и последующей экспериментальной и клинической валидации.