Исследователи, которые хотят выполнить секвениро- вание нового поколения (NGS), должны решить ряд проблем, связанных со способами и методами подго­товки образцов. Способы экстракции РНК из тканей или клеток, создание базы данных для секвенирования и типов секвенирования, которые будут выполняться, становятся решающими факторами в дизайне экспери­ментальной работы [1]. В частности, для секвенирова­ния различных классов молекул РНК, по крайней мере частично, определяются и упорядочиваются по их раз­меру. Микро-РНК (miRNAs, 18-22 нуклеотида), малые интерферирующие РНК (siRNAs, 20-25 нуклеотидов) и PIWI-взаимодействующие РНК (piRNA, приблизи­тельно 30 нуклеотидов) являются разновидностями малых некодирующих РНК, участвующих в последова­тельном ингибировании экспрессии генов на посттран- скрипционном уровне [2]. Хотя в настоящее время ма­лые РНК известны как наименьший функциональный класс, но их биологическая значимость для регулирова­ния экспрессии генов все еще изучается на протяжении 20 лет с момента их открытия [3]. С недавних пор NGS используется для получения небольших дифференци­альных профилей экспрессии РНК для изучения этапов развития тканей, типов тканей и патологических со­стояний, таких как онкология, сердечно-сосудистые за­болевания и психические расстройства с потенциалом для поиска новых биомаркеров [4-7].

До недавнего времени считалось, что способы экстрак­ции РНК из тканей позволяли извлекать все виды РНК: примерно от длинных до малых РНК, которые включают кодирующие РНК (мРНК), длинные некодирующие РНК (lncRNA), транспортные РНК (тРНК), малые ядрышковые РНК (snoRNA), PIWI -взаимодействующие РНК (piRNA) и микро-РНК (miRNA) [2]. Экстракция всех видов РНК подразумевается в описании многих коммерчески до­ступных наборов и методов, описывающих изоляцию тотальной РНК. Фактически они используются для мето­дов, которые вообще не извлекают малые РНК, но имеют­ся такие наборы, которые основываются на использова­нии мини-колонок с диоксидом кремния (SiO2), которые и проводят экстракцию малых РНК. Кроме того, в ряде наборов использовались соотношения солей и спирта, не достаточные для изоляции малых РНК из образцов. В настоящее время существует множество коммерчески доступных наборов для экстракции малых РНК. Хотя ме­тодики имеют некоторые отличия, большинство из них используют тиоцианат гуанидиния для денатурирования РНКаз и белков с последующей экстракцией РНК с фе­нол-хлороформом [8, 9]. Систематическое тестирование показало, что производительность наборов для изоляции РНК варьируется в зависимости от типов образцов [10]. Ряд наборов лучше подходят к конкретным видам об­разцов, чем к другим. Например, соединительная ткань, такая как мышечная, должна обрабатываться иначе, чем богатая липидами нервная ткань. Лучшим вариантом мо­жет быть выбор комплекта, специально разработанного для решения проблем с экстракцией РНК для конкретно­го типа ткани.

Из трех лучших наборов для изоляции тотальной РНК и ее фракций набор MaxRecovery BiooPure RNA (Bio Scientific, Austin, TX, USA) не был выбран, так как про­являлась некоторая потеря РНК в отдельных образцах. Стандартный набор MirVana Kit (Life Technologies), ко­торый в своей методике не предлагает исследователям возможность выделения белка из исходного лизата, хо­рошо работает, но не был выбран, потому что первый буфер добавляется в соотношении 10:1 к объему образ­ца. Таким образом, для каждого образца объемом 1 мл потребуется более 50 отдельных этапов центрифугиро­вания, что делает этот метод логически необоснован­ным для выделения РНК из биологических жидкостей. Набор MirVana PARIS (выделения белка и РНК) Kit (Life Technologies) наилучшим образом обеспечивал выход РНК вследствие легкости применения при системати­ческом сравнении с другими коммерчески доступными наборами и методами [10].

Набор MirVana PARIS включает использование запатен­тованного лизирующего буфера с β-меркаптоэтанолом, который служит для денатурирования белков био­логических жидкостей, экстракции РНК фенол-хло­роформом из образца, с высоким содержанием белка, липидов и ДНК, с последующей очисткой на спирто­вой/колоночной основе перед элюированием РНК. В этой работе мы описываем метод экстракции малых РНК длиной менее 200 нуклеотидов из биологических жидкостей человека и его оптимизацию по экстракции малых РНК длиной менее 200 нуклеотидов из биологи­ческих жидкостей человека [10]. Основные изменения в дополнение к стандартному протоколу, предоставлен­ному изготовителем, включают повторное извлечение РНК вместо удаления остаточного фенол-хлороформа путем добавления воды, свободной от РНКаз, ремик- сации и отделения другого объема раствора. Хотя уро­вень для лучшей экстракции малых РНК с использова­нием модификаций, предложенных в этой работе, будет варьироваться в зависимости от конкретного набора, к которому применяется эта методика, было показано, что он обладает кроссплатформенной применимостью [10]. Наборы, использующие кислота-фенол-хлоро- формную основу, могут быть полезны с некоторыми дополнениями для набора mirVana PARIS. Выход РНК из всех образцов, которые были протестированы, полу­чался из второй водной экстракции из остаточного кис- лота-фенол-хлороформного материала [10]. Поскольку современные методы NGS для малых РНК выполня­ются отдельно от РНК с более длинной цепочкой ну­клеотидов, тот факт, что лучшие наборы для изоляции малых или больших молекул РНК различны, не пред­ставляет проблем на момент этой работы.

После взятия биологической жидкости (цереброспи­нальная жидкость) помещаем образцы в криопробирки 2 мл, их необходимо быстро заморозить в жидком азоте либо в суспензии абсолютного этанола с сухим льдом, чтобы сохранить профиль РНК (см. примечание 13). Использование шкафа биобезопасности требуется при обращении с биологическими образцами для защи­ты исследователей от воздействия патогенов человека.

Мы протестировали различные коммерчески доступные наборы для извлечения РНК и обнаружили, что некото­рые из них были более эффективными при выделении малых РНК из биологических жидкостей, чем другие. Также были проверены модификации протоколов, сде­ланных другими исследователями, для более высокого выхода РНК [13]. Лучшие условия для получения высо­кого выхода малых РНК из биожидкостей описаны в этой методике, так как мы считаем, что она имеет ценность для исследователей, которые планируют работать с NGS. Настоящее исследование специально было разработано и протестировано для изоляции малых РНК из церебро­спинальной жидкости человека для последующей рабо­ты с NGN на платформе Illumina (Illumina, San Fransico, CA, USA). Также метод может быть дополнительно при­менен к образцам слюны и мочи человека [14]. Описанный здесь метод был протестирован и показал, что он улучшает восстановление или выделение малых РНК из цереброспинальной жидкости. Однако этот ме­тод не ограничивается этим типом образцов и может разумно применяться к другим типам биологических жидкостей [15]. Поскольку каждый тип выборки может создавать определенные проблемы, мы настоятельно рекомендуем тестировать различные методы для каж­дого конкретного типа образца, т. е. типа ткани. Доказана роль секвенирования следующего поколения в дифференциальной диагностике сложных новообра­зований. Acosta и др. оценили потенциальное примене­ние NGS в диагностике этих редких новообразований [16]. В исследование были включены четыре новооб­разования. Два были диагностированы как смешанная аденонейроэндокринная карцинома желчного пузыря и метастатический папиллярный рак щитовидной желе­зы с плоскоклеточной дедифференцировкой, а два были интерпретированы как аденокарцинома пищевода в аде­нокарциному легких и мелкоклеточная карцинома лег­кого на/в менингеальную меланому. Это исследование иллюстрирует роль NGS в дифференциальной диагно­стике редких новообразований как дополнения к свето­вой микроскопии и иммуногистохимии.

В этой статье мы описали методику для экстракции ма­лых РНК из биологических жидкостей человека для по­следующего секвенирования нового поколения, кото­рую сочли полезной при исследованиях данных типов РНК в качестве потенциальных биомаркеров. Как ука­зано выше, подготовка образцов, выбор реагентов — немаловажные факторы, учитывая текущую нехватку знаний об их влиянии на последующее секвенирование нового поколения малых РНК. Кроме того, тщательно построенный план эксперимента, связанный с выбо­ром типов образцов и техники экстракции малых РНК, важен для получения хороших результатов в работе с секвенированием нового поколения.