История коронавируса человека началась в 1966 году, когда Tyrrell и Bynoe описали перевиваемый вирус, названный ими В814. Он был получен из респираторного тракта взрослых людей, больных простудой, при выращивании вируса в клеточных культурах эмбриональной трахеи [1]. В дальнейшем под руководством Tyrrell была изучена группа вирусов человека и животных, которые вызывали разнообразные заболевания. Эти вирусы были объединены в одну группу в связи с характерным внешним видом при электронной микроскопии (выступы на поверхности, напоминающие корону) и наличием РНК [2]. Сероэпидемиологические исследования, проведенные в 1962–1964 и в 1965–1966 годах, показали, что коронавирусы (CoVs) могут вызывать до 30 % всех острых респираторных вирусных инфекций [3]. В 2002– 2003 годах CoVs стали причиной развития тяжелого острого респираторного синдрома SARS (Severe acute respiratory syndrome coronavirus), вызванного SARS-CoV. В ходе эпидемии SARS было выявлено около 8000 больных людей, из которых 774 умерло (9,6 %) [4]. В сентябре 2012 года ВОЗ впервые доложила о новой коронавирусной зооантропонозной инфекции MERS (Middle East respiratory syndrome), вызванной MERS-CoV, на Ближнем Востоке (около 80 % случаев — в Саудовской Аравии). MERS была зарегистрирована в 27 странах. По состоянию на 31 июля 2019 года ВОЗ зарегистрировала 2458 лабораторно подтвержденных случаев MERS, летальность от которых составила 34 % [5].

В декабре 2019 года в городе Ухань провинции Хубэй в Китае произошла вспышка пневмонии, эпидемиологически связанная с оптовым рынком морепродуктов Хуанань, где продавались живые животные (закрыт 1 января 2020 года). Были исключены такие инфекции, как грипп, птичий грипп, MERS, SARS и другие. Исследователи из Китая 7 января 2020 года выявили и секвенировали геном нового вируса, полученного от инфицированного человека. 12 января 2020 года в международной базе данных Genbank для всего мира стала доступной нуклеотидная последовательность (НП) нового вируса [6], который, согласно Международному комитету по таксономии вирусов (ICTV) был назван SARS-CoV-2 (www.ictvonline.org). Природным резервуаром SARS-CoV-2 могут служить летучие мыши, такие как Rhinolophus affinis [7]. Эти данные был получены на основании сравнительного филогенетического анализа вируса с другими CoVs, показавшего, что новый вирус на 96 % идентичен SARSподобным CoVs летучих мышей (bat-SL-CoVZX45 и bat-SL-CoVZX21). Однако пока точно не установлено — благодаря какому промежуточному хозяину вирус смог преодолеть межвидовой барьер для заражения людей [8]. Вирус SARS-CoV-2 является причиной развития новой болезни, названной COVID-19, которая быстро распространилась по всему миру [7], в связи с чем 19 марта 2020 года ВОЗ объявила о глобальной пандемии COVID-19 (who.int/ru).

Согласно Международному комитету по таксономии вирусов, CoVs являются членами семейства Coronaviridae отряда Nidovirales. Они относятся к крупнейшим из известных вирусов с одноцепочечной «плюс-нитевой» РНК. Диаметр их сферических частиц составляет от 100 до 160 нм, а размер генома — от 27 до 32 т.п.н. В соответствии с геномной организацией и филогенетическими связями подсемейство Orthocoronavirinae подразделено на 4 рода: Alphacoronavirus (α-CoV), Betacoronavirus (β-CoV), Gammacoronavirus (γCoV) и Deltacoronavirus (δ-CoV). Из них к α-CoV относятся Alphacoronavirus 1, Human coronavirus 229E, Human coronavirus NL63, Miniopterus bat coronavirus 1, Miniopterus bat coronavirus HKU8, Porcine epidemic diarrhea virus, Rhinolophus bat coronavirus HKU2, Scotophilus bat coronavirus 512. Они вызывают желудочно-кишечные расстройства у человека, собак, кошек и свиней. Представителями β-CoV являются Betacoronavirus 1, Human coronavirus HKU1, Murine coronavirus, Pipistrellus bat coronavirus HKU5, Rousettus bat coronavirus HKU9, SARS-CoV, MERS-CoV и SARS-CoV-2. Они инфицируют только млекопитающих. Вирусы рода γCoV и δ-CoV вызывают болезни у птиц, к δ-CoV относятся Andecovirus, Buldecovirus, Herdecovirus; γCoV включают виды Brangacovirus, Cegacovirus, Igacovirus. Основным природным резервуаром α-CoV и β-CoV являются летучие мыши [9][10].

Было подтверждено высокое сходство (более 99 %) всех известных секвенированных геномов SARS-CoV-2 [10], которые более чем на 70 % сходны с SARS-CoV [6] и в меньшей степени — с MERS-CoV. У человека рецептором для SARS-CoV-2 и SARS-CoV является ангиотензин-превращающий фермент 2-го типа (ACE2). Однако SARS-CoV-2 связывается с ним слабее, чем SARS-CoV, что соответствует менее тяжелой инфекции. Кроме того, SARS-CoV содержит белок, кодируемый ORF3B, который ингибирует экспрессию IFNβ [8]. Размер генома SARS-CoV-2 29,8 — 29,9 т.п.н., а его структура соответствует специфическим характеристикам известных CoV (рис. 1).

Еще в 1975 году отечественный вирусолог В.М. Жданов обнаружил, что ДНК-транскрипты инфекционных РНК-вирусов встраиваются в геномы клеток хронически инфицированных тканевых культур. Кроме того, в тканях людей, пораженных системной красной волчанкой, были выявлены последовательности ДНК, гомологичные РНК вируса кори [24]. В 1997 году Klenerman et al. при изучении инфекции, вызванной РНК-вирусом лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), показал, что вирусные антигены могут персистировать в лимфоидной ткани в течение фазы иммунологической памяти. Но при этом РНК генома вируса не обнаруживается. Однако при помощи ПЦР были выявлены специфические для LCMV последовательности ДНК в клетках селезенки мышей через 200 дней после заражения. Было доказано, что обратная транскрипция вирусной РНК в комплементарную ДНК (кДНК) происходит после острой инфекции клеток ее естественных хозяев за счет эндогенной активности обратной транскриптазы (RT) хозяев [25]. В 2009 году Geuking et al. в экспериментах на мышах описали незаконную рекомбинацию между РНК вируса LCMV и эндогенной частицей ретроэлемента (РЭ) IAP (Intracisternal A-type Particle) с обратной транскрипцией экзогенной вирусной РНК. В результате кДНК интегрировала в геном хозяина при помощи IAP элемента [26]. В разное время после инфекции в клетках человека (293T) были выявлены кДНК вируса везикулярного стоматита (NRRV семейства Rhabdoviridae), образованные при помощи белков LINE-1 элемента клеток [27].

Фрагменты ДНК последовательностей NRRV арбовирусов были обнаружены в клетках комаров на ранней стадии инфекции в виде эписомных форм ДНК. По данным секвенирования нового поколения и биоинформационного анализа было доказано, что эти НП интегрированы в геном хозяев. Данное явление, как предполагается, связано с вирусной персистенцией и иммунным ответом хозяина [20]. Встройка фрагментов вирусных НП может привести к хронической инфекции. Однако клетки животных могут извлекать выгоду от инсертированных в их геномы НП вирусов, например для управления развитием клеток хозяев или для сайленсинга чужеродных инвазий и поддержания иммунной памяти. Клетки хозяев могут экспрессировать вирусные пептиды из открытых рамок считывания интегрированных вирусных НП для усиления адаптивных В- и Т-клеточных ответов в течение длительного времени после освобождения организма от реплицирующихся вирусов. Подтверждением этого является то, что для вирусов, которые заражают остро (ортомиксовирусы и вирус коровьей оспы), характерна последующая необъяснимо длительная персистенция вирусных НП и пептидов с наличием вирус-специфического адаптивного иммунитета [19]. Было доказано, что образованные в результате встроек кДНК фрагментов генома вируса эндогенные вирусные элементы (EVE) могут функционировать в качестве шаблонов для биогенеза PIWI-взаимодействующих РНК (piРНК) у комаров и 48 видов членистоногих, что говорит о роли EVE в формировании иммунологической памяти. Эти EVE соответствуют в основном одноцепочечным NRRV семейств Rhabdoviridae и Parvoviridae [21].

Доказательствами интегративной способности фрагментов NRRV являются также данные филогенетических исследований. В 2004 году Crochu et al. выявили мультигенную последовательность флавивируса в геноме комаров Aedes albopictus и Aedes aegypti [28]. В 2010 году Katzourakis и Gifford провели скрининг геномов животных in silico для идентификации EVE, происходящих от NRRV. Было выявлено множество EVE, происходящих от представителей семейства Bornaviridae и Filoviridae у млекопитающих, Rhabdoviridae, Orthomyxoviridae, Reoviridae, Flaviviridae у насекомых. Из них Filoviridae, Rhabdoviridae, Reoviridae и Flaviviridae, подобно коронавирусам, реплицируются в цитоплазме [29]. В геномах человека и других приматов, а также у грызунов и слонов были выявлены элементы, гомологичные нуклеопротеину (N) вирусов семейства Bornaviridae. Эти EVE, обозначенные как EBLN (endogenous Borna-like N elements), могут содержать интактную ORF и экспрессируются в виде мРНК хозяев. Филогенетический анализ показал, что EBLN были образованы различными инсерционными событиями для каждого семейства животных на разных этапах эволюции [30]. В 2010 году Teylor et al. представили прямые доказательства наличия EVE, происходящих от реплицирующихся вне ядра представителей семейства Filoviridae, в геномах летучих мышей, грызунов, тенреков, землеройковых и сумчатых [31]. В том же году Belyi et al. провели сравнительный анализ 5666 генов всех известных семейств одноцепочечных NRRV с геномами 48 видов позвоночных. Было доказано происхождение 80 EVE (возникших около 40 миллионов лет назад) от фрагментов геномов древних членов 4 циркулирующих в настоящее время семейств вирусов у 19 изученных видов позвоночных. Интеграция была показана в том числе для «плюс-нитевых» одноцепочечных РНК-вирусов семейства Flaviviridae, реплицирующихся в цитоплазме [32], подобно коронавирусам.

Вышеперечисленные данные о встройках кДНК фрагментов NRRV в геномы хозяев и даже их сохранении в эволюции позволяют сделать предположение о наличии сходных свойств у SARS-CoV-2. Косвенными подтверждениями данного предположения могут служить специфические особенности CoVs и вызванных ими заболеваний. Так, при исследовании коронавирусной инфекции ЦНС у мышей Bergmann et al. еще в 2006 году показали персистенцию CoV, несмотря на наличие врожденного иммунного ответа и специфических эффекторных механизмов хозяина, контролирующих репликацию вируса в различных типах клеток головного мозга [33]. Так как в персистенции NRRV может играть роль интеграция вируса в геном хозяев [20], можно предположить, что хроническая инфекция CoV у мышей обусловлена встройкой кДНК фрагментов генома вируса. В пользу этого говорят также факты интеграции фрагментов геномов плюс-нитевых РНК-вирусов, реплицирующихся, подобно CoVs, в цитоплазме [29][32].

Было проведено подробное изучение последовательностей SARS-CoV-2, других коронавирусов и HIV-1, с использованием базы данных GenBank. В результате выявлены специфические встройки кДНК фрагментов генома вируса, идентичные или высокогомологичные генам хозяев (млекопитающих и насекомых) [34]. Эти НП могли быть получены путем встраивания фрагментов последовательностей CoV в геномы хозяев с использованием белков РЭ хозяев и сохранением их в ходе эволюции, подобно другим NRRV [27][28][29][30][31]. Образуемые вставки способны генерировать вирусные РНК с измененными последовательностями, которые способны использоваться для рекомбинации при коронавирусной инфекции, что может объяснить возникновение новых разновидностей вируса, в том числе SARS-CoV-2. Одним из фактов, позволяющих сделать это предположение, является обнаружение частиц CoVs в ядрах пораженных клеток [35][36][37][38].

Еще в 2004 году Qinfen et al. при изучении жизненного цикла SARS-CoV в клетках почек африканских зеленых мартышек выявили специфический феномен образования вирусоподобных частиц в ядрах инфицированных клеток [35]. В последующих исследованиях была доказана локализация различных компонентов CoVs в ядрах пораженных клеток. Так, белок 3b SARS-CoV располагается преимущественно в ядре совместно с важными белками ядрышка (C23) [37]. В исследовании Matthews et al. в 2014 году при определении субклеточной локализации белковых продуктов ORF4b (p4b) вирусов MERS-CoV, BtCoV-HKU4 и BtCoV-HKU5 было показано их расположение в ядрах клеток. Вспомогательный белок p4b участвует в защите от врожденного иммунитета путем ингибирования путей передачи сигналов интерферона-1 и NF κB [38]. Белок 9b вируса SARS-CoV, способный проникать в ядро посредством пассивного транспорта независимо от клеточного цикла, взаимодействует с клеточным белком Crm1 и выходит из ядра при помощи активных сигналов ядерного экспорта, при дефиците которых белок 9b индуцирует апоптоз клеток [39].

Белок N различных коронавирусов, в том числе SARSCoV, также локализуется не только в цитоплазме, но и в ядах пораженных клеток [36]. Было показано, что белок N вируса SARS-CoV посредством специфического домена связывается с гетерогенным ядерным рибонуклеопротеином А1, который участвует в сплайсинге пре-мРНК в ядрах и в регуляции трансляции в цитоплазме [40]. Можно предположить, что в развитии противовирусного ответа на SARS-CoV-2 определенную роль могут играть индивидуальные особенности состава и распределения РЭ, а также состояние их активности в геноме больных людей, так как RT и интеграза ретроэлементов могут участвовать во встраивании коронавирусов в геном человека. С этим можно связать тяжелое течение COVID-19 у пожилых пациентов [8], так как при старении наблюдается патологическая активация РЭ [41]. Кроме того, у больных SARS одним из целевых аутоантигенов оказалась эндонуклеаза (EN) ретроэлемента LINE-1, экспрессия которого была измененной в легочной ткани пораженных людей. Антитела против EN были выявлены у 40,9 % пациентов с SARS [42]. Не исключено развитие подобных механизмов для COVID-19.

SARS-CoV-2 заражает эпителиальные клетки альвеол легких при помощи рецептор-опосредованного эндоцитоза через ACE2 [43]. Вирус проходит через слизистую оболочку носа и гортани, далее через дыхательные пути проникает в легкие, из которых проникает в периферическую кровь, вызывая виремию. В результате SARS-CoV-2 может поражать целевые органы, экспрессирующие ACE2, такие как сердце, почки, желудочно-кишечный тракт и вторично легкие [14]. Белок S стимулирует воспалительные реакции посредством активации толл-подобных рецепторов 2 (TLR2). Белок Е является виропорином и усиливает активность инфламмасомы NLRP3, приводя к гиперпродукции IL-1β и развитию иммунопатологии хозяина [12]. Тяжелое течение болезни может быть обусловлено патологическим иммунным ответом, «цитокиновым штормом», при котором высвобождение медиаторов воспаления инициирует петлю положительной обратной связи, приводящей к ОРДС. У больных COVID-19, нуждающихся в интенсивной терапии, выявляются значительно более высокие уровни маркеров воспаления IL-2, IL-7, IL-10, GSCF, IP10, MCP1, MIP1, TNF-alpha. При тяжелом течении COVID-19 и в тканях легких умерших больных определяется чрезмерно активированный иммунный ответ с патогенными Тh1 лимфоцитами и моноцитами [15]. При этом наблюдается аномальная выработка интерферонов с высокими уровнями провоспалительных цитокинов, таких как IL-1, IL-6, IL-8 и CXCL-10, в легких [12].

При проникновении в организм хозяина вирус вначале распознается врожденной иммунной системой через специфические рецепторы PRRs (pattern recognition receptors), в том числе лектиноподобные рецепторы С-типа, toll-подобный (TLR3, TLR4), RIG-I-подобный (индуцируемый ретиноевой кислотой), MDA-5 (ассоциированный с дифференцировкой меланом белок 5) и NOD-подобный рецепторы. Активация сенсоров приводит к стимуляции регуляторных факторов интерферонов IRF3 и IRF7, а также NF-κB. Они стимулируют экспрессию и выработку интерферона I типа и провоспалительных цитокинов, которые активируют сигнальный каскад JAK-STAT, индуцирующий экспрессию множества антивирусных интерферон-стимулированных генов [8][12].

Инфекционный процесс при коронавирусной инфекции имеет много неразрешенных моментов, так как, несмотря на развитие гиперактивности иммунной системы с развитием «цитокинового шторма», CoVs противодействуют защитным механизмам хозяев различными путями. Так, белок N вируса SARSCoV может использоваться вирусом для уклонения от иммунных реакций хозяина [8]. CoVs используют стратегии для противодействия PKR-опосредованной передаче сигналов, чтобы предотвратить отключение трансляции из-за фосфорилирования eIF2α (eukaryotic Initiation Factor 2α). Белки S вируса SARS-CoV физически взаимодействуют с eIF3F (eukaryotic translation Initiation factor 3 subunit F), модулируя трансляцию хозяина, в том числе экспрессию провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-8, на поздней стадии инфекции. Кроме того, nsp1 блокирует передачу сигналов интерферона путем снижения количества фосфорилированных STAT1 (signal transducer and activator of transcription 1) в инфицированных клетках. Продукты ORF3b и ORF6 вируса SARS-CoV блокируют экспрессию и передачу сигналов интерферона. Белки М связываются с TRAF3 (TNF receptor-associated factor 3) и предотвращают его связывание с TBK1 (TANK-binding kinase 1). В результате блокируется IRF3-опосредованная передача сигналов [12]. Вспомогательный белок 6 вируса SARS-CoV характеризуется взаимодействием с внутриклеточными мембранными структурами клеток и за счет высокой полярности 20 остатков аминокислот на его С-конце препятствует транспорту сигнальных белков, необходимых для врожденных иммунных реакций. Это обеспечивается путем взаимодействия С-конца с кариоферинами KPNA2 и KPNB1 [44].

Несмотря на интенсивное изучение SARS-CoV-2, в настоящее время не разработана эффективная кандидатная вакцина и специфическая противовирусная терапия COVID-19. В настоящее время проводится множество клинических исследований различных потенциальных противовирусных препаратов. Необходимо отметить, что экспериментальные препараты для лечения COVID-19 следует использовать только в утвержденных рандомизированных контролируемых исследованиях https://clinicaltrials.gov/ (apps.who.int). В данном отношении предполагается дальнейшее исследование возможности применения и исследования эффективности аналогов нуклеозидов (ремдисивир), пептида EK1, ингибиторов нейраминидазы и синтеза РНК (TDF, 3TC), а также противовоспалительных препаратов [45]. Предсказана также вероятность использования препаратов, подавляющих проникновение SARS-CoV-2 в клетки-мишени. К ним относится барицитиниб, который используется для лечения ревматоидного артрита и является ингибитором киназы AAK1. Возможный эффект связан с тем, что AAK1 ассоциирована с AP2 (Adaptor protein complex 2) и ее подавление препятствует рецептор-опосредованному эндоцитозу CoV через рецептор ACE2 [43]. Большое значение имеет разработка терапии с учетом патогенеза тяжелых форм, при которых развивается «цитокиновый шторм». В данном отношении возможно применение глюкокортикоидов для ОРДС при COVID-19, а также проводятся многоцентровые клинические испытания блокатора рецептора IL-6 тоцилизумаба [15].

В связи с предполагаемой ролью встроек кДНК фрагментов генома вируса SARS-CoV-2 в патогенезе COVID-19 (гиперактивный иммунный ответ у пожилых пациентов [15], вероятно, связанный с повышенной экспрессией РЭ в их геномах [41]) в качестве потенциальных препаратов для лечения COVID-19 могут быть предложены ингибиторы RT, которые эффективно применяются в терапии злокачественных новообразований [46]. Перспективным в лечении COVID-19 может быть таргетная терапия с использованием микро-РНК. В отношении SARS-CoV-2 miR-1307-3p и miR-3613-5p могут предотвращать репликацию вируса путем нацеливания на 3’-UTR его генома [47]. В Индии были определены 9 различных микро-РНК человека, нацеленных на гены SARS-CoV-2: hsa-let-7a, hsa-miR101, -125a-5p, -126, -222, -23b, -378, -380-5, -98. Из них для hsa-let-7a, hsa-miR126, hsa-miR378 и hsamiR98 мишенью оказался также ген IFNβ в организме человека [48].

К наиболее успешным кандидатным вакцинам, перешедшим в клиническую разработку, относятся мРНК1273 (LNP-инкапсулированная мРНК, кодирующая белок S), Ad5-nCoV (аденовирусный вектор-5, экспрессирующий белок S), INO-4800 (ДНК-плазмида, кодирующая белок S), LV-SMENP-DC (дендритные клетки, модифицированные лентивирусным вектором, экспрессирующим миниген на основе доменов вирусных белков), патоген-специфичная aAPC (искусственная антигенпрезентирующая клетка, модифицированная лентивирусным вектором, экспрессирующим синтетический миниген на основе доменов вирусных белков) [49]. Приведенные в статье данные о способности NRRV к интеграциям в геномы хозяев позволяют предположить, что при использовании вакцины от COVID-19 необходимо учитывать возможность встроек кДНК фрагментов вируса в геном человека [23][25][26].

Анализ литературных данных о роли интеграции вирусных фрагментов в инфекционных процессах NRRV позволил предположить, что в развитии COVID-19 определенную роль могут играть индивидуальные особенности активности РЭ в геномах больных. Это связано с возможным взаимодействием продуктов их экспрессии с SARS-CoV-2. В качестве подтверждения приведены данные об утяжелении клиники у пожилых пациентов (вероятно, обусловленной патологической активацией РЭ при старении), наличии бессимптомного носительства и сохранении экспрессии вирусных последовательностей даже через 14 дней после выздоровления от COVID-19. Кроме того, у больных SARS выявлено изменение активности LINE-1 и выработка антител против их эндонуклеазы. Взаимодействие SARS-CoV-2 с продуктами экспрессии РЭ могло стать причиной возникновения нового коронавируса в связи с возможной рекомбинацией вирусных и клеточных РНК. Перспективным направлением в исследовании COVID-19 может стать определение наличия и особенностей встроек кДНК фрагментов последовательностей SARS-CoV-2 в геномы вирусоносителей, что может стать основой для разработки эффективной вакцинопрофилактики болезни. Отражением особенностей функционирования РЭ являются малые некодирующие РНК, поэтому в разработке подходов противовирусной терапии важную роль могут играть результаты анализа экспрессии микро-РНК при различных клинических вариантах COVID-19 с учетом возможных особенностей встроек кДНК фрагментов вируса SARS-CoV-2 в геномы пациентов с тяжелым течением. В связи с этим предполагается проведение ПЦР-диагностики для обнаружения не только РНК, но и инсертированной ДНК SARS-CoV-2, а также определение противовирусных антител у пациентов в различные периоды после перенесенной инфекции.

Одни продукты экспрессии (белки S и Е) вирусов активируют воспалительные реакции, в то время как другие (белки N, M, nsp1, nsp6, ORF3b, ORF6) препятствуют развитию иммунных реакций организма. В связи с этим влияние определенных клеточных факторов на преобладание экспрессии специфических генов вируса может определять течение инфекции от стертых форм до тяжелых с развитием «цитокинового шторма». Наиболее интересными клеточными факторами в плане разработки методов лечения COVID-19 являются микро-РНК, изменения экспрессии которых при болезни доказаны. Кроме того, в настоящее время появляются данные о наиболее эффективных терапевтических агентах для лечения COVID-19, к которым относится барицитиниб. Для подавления «цитокинового шторма» применяют нестероидные противовоспалительные препараты и глюкокортикоиды, планируется использование блокатора интерлейкинового рецептора тоцилизумаба.