Клеточная терапия определяется как трансплантация человеческих клеток для замены или восстановления поврежденных тканей и/или клеток, где стромально-васкулярная фракция (СВФ) занимает особое место [1]. СВФ представляет собой гетерогенную универсальную клеточную систему, и степень гетерогенности зависит от множества факторов, таких как место забора жировой ткани, методы выделения и собственный патологический статус пациента [1]. На сегодня не существует единого определения, позволяющего различать конкретные пропорции этих составляющих друг к другу. Ясно то, что СВФ представляет собой динамическую популяцию клеток с потенциально значимой полезностью в клинике. Известно, что СВФ содержит эндотелиальные клетки (ЭК), гладкомышечные клетки, муральные клетки, фибробласты, макрофаги, мезенхимальные стволовые клетки (МСК) / другие фенотипы стволовых клеток и т. д. (рис. 1) [2].

Среди этих клеток основное внимание было сосредоточено на характеристиках и функциях стромальных/ стволовых клеток, полученных из жировой ткани, которые обычно называют стволовыми клетками, полученными из жировой ткани (СКЖТ) или МСК жировой ткани [3]. СВФ используется в течение многих лет в пластической хирургии для регенерации тканей методом аутологичной трансплантации, без какого-либо акцента на потенциальную аллогенную роль СВФ [4]. Кроме того, ангиогенные свойства, противовоспалительная и иммуномодулирующая активность СВФ также позволяет рассматривать их как потенциальную клеточную терапию при различных заболеваниях и травмах [5].

Клиническое использование методов лечения на основе аутологичных клеток с использованием жировой ткани в качестве источника клеток может осуществляться с использованием двух различных подходов: с использованием выращенных СКЖТ или свежевыделенной СВФ (табл. 1).

Образец Заболевание или травма Фаза Безопасность и эффективность СКЖТ Свищ прямой кишки (перианальный свищ) II Безопасное и эффективное лечение. Повышенная скорость заживления свищей в группе,получавшей клеточную терапию СКЖТ Свищ прямой кишки при болезни Крона I Безопасная процедура СВФ Радиодермит I Безопасное и эффективное лечение. Улучшение или ремиссия поражений СВФ Стрессовое недержание мочи у пациентов, перенесших радикальную простатэктомию I Безопасная процедура. Видимые улучшения по нескольким параметрам СВФ Идиопатический фиброз легких I Безопасная процедура СВФ Дефект и деформация мягких тканей лица I Безопасная процедура СКЖТ Повреждение спинного мозга I Безопасная процедура

Таблица 1. Список некоторых клинических испытаний, в которых используется стромальная сосудистая фракция (СВФ) или стволовые клетки, полученные из жировой ткани (СКЖТ) Table 1. Selected clinical trials exploiting stromal vascular fraction (SVF) or adipose tissue stem cells (ATSC)

На процесс принятия решений влияют различные факторы, но наиболее важными из них являются необходимые нормативные требования, наличие утвержденных правил GMP (надлежащая производственная практика), связанные с этим затраты, дозировка клеток и время обработки. Использование выращенных культур СКЖТ позволяет персоналу очищать и увеличивать количество клеток-предшественников с течением времени (несколько недель) в культуре, что создает последовательную и относительно однородную популяцию клеток. Эта процедура проводится в строго контролируемых условиях правил GMP, но является дорогостоящей и занимает несколько недель, чтобы подготовить рабочий образец для инъекций [6][7]. Использование свежеизолированных образцов СВФ в месте оказания медицинской помощи в режиме реального времени во время одной и той же хирургической процедуры имеет важные преимущества: меньшая вероятность инфицирования (особенно при использовании закрытых устройств обработки), более быстрая обработка и клиническое применение, а также меньшие связанные с этим расходы [8].

Фармацевтическая промышленность активно участвует в клеточной терапии и поддерживает клиническое использование культивируемых клеток. И наоборот, биотехнологические компании, которые создают или производят медицинские устройства, продвигают использование свежевыделенных клеток, готовых к использованию у постели больного. У обеих стратегий есть свои плюсы и минусы, но удивительно мало научных или клинических исследований, сравнивающих оба типа клеток для одного и того же заболевания или клинического показания. Существует неопределенность в отношении того, какая популяция клеток будет более эффективной при различных клинических состояниях: гетерогенная СВФ или культуры СКЖТ. Несколько исследований показали улучшенные результаты со свежеполученными образцами СВФ по сравнению с культурами СКЖТ. Например, Semon и др. сообщили, что внутрибрюшинная инъекция в количестве 1 миллиона клеток СВФ была более эффективной, чем СКЖТ, с ингибированием прогрессирования аутоиммунного энцефаломиелита in vivo [8]. В другом исследовании Jurgens и др. были показаны лучшие результаты свежевыделенных образцов СВФ по сравнению с культивируемыми СКЖТ в стимулировании регенерации хрящевой ткани и субхондральной кости in vivo [9]. Все эти исследования показали безопасность и осуществимость клеточной терапии на основе СВФ без каких-либо побочных эффектов. В последнем исследовании Wu и др. в 2016 году продемонстрировали, что СВФ лучше, чем СКЖТ; при использовании СВФ происходило более быстрое формирование нового хрящевого матрикса при совместной инкубации с первичными хондроцитами человека in vitro [10].

Существует множество методов, доступных для выделения СВФ, но в целом они делятся на две основные категории: те, которые используют протеолитические ферменты для диссоциации липоаспирата (ферментативный метод), и те, которые не используют (механический метод). Механический метод включает такие подходы, как промывание, встряхивание, вибрация или центрифугирование, чтобы отделить популяции клеток СВФ от липоаспирата. Ферментативный метод сочетает промывание и встряхивание с использованием протеолитических ферментов, способствующих диссоциации тканей. У обоих методов есть свои преимущества и недостатки (табл. 2) [11][12].

Ферментативный метод Механический метод Ферментативный метод позволяет получить значительно больше ядерных клеток из эквивалентной массы ткани, чем механический метод, и имеет тенденцию выделять более низкую частоту по содержанию клеток гематопоэтического происхождения и более высокую частоту содержания стромальных/стволовых клеток. Использование протеолитических ферментов, обычно коллагеназы и/или нейтральной протеазы, может потенциально внести дополнительный риск в процесс, поскольку любой из них может потенциально вызвать аллергическую реакцию или нежелательное разрушение ткани in vivo, если не удаляется или не нейтрализуется надлежащим образом во время выделения Преимущество механического метода состоит в том, что он менее дорог и занимает немного времени по сравнению с ферментативным методом, потому что нет необходимости покупать дорогостоящие протеолитические ферменты, пригодные для надлежащей производственной практики (GMP), и нет необходимости включать стадию расщепления в процесс выделения. Механический метод обычно занимает от 20 до 40 минут, тогда как ферментативный метод обычно занимает от 60 до 90 минут. Механический метод может быть экономически эффективным в лабораторных условиях, где может не потребоваться большого количества клеток или ткани, но ферментативный метод, как правило, идеален для применения в клинических условиях из-за лучшего фенотипического состава выделенных клеток

Таблица 2. Преимущества и недостатки методов выделениястромально-васкулярной фракции (СВФ) Table 2. Pros and contras of stromal vascular fraction (SVF) extraction methods

Существует множество систем выделения, которые коммерчески доступны. Эти системы упрощают процесс, предоставляя все необходимые расходные материалы и реагенты в одноразовом комплекте. Они предлагают заметное преимущество в виде замкнутых систем, что снижает риск загрязнения во время выделения и может устранить необходимость в защитном кожухе биобезопасности [13]. Коммерчески доступные наборы (kit), как правило, менее изменчивы, чем традиционные методы, использующие лабораторное оборудование и стеклянную посуду (например, делительную воронку, химические стаканы) [14]. Этот подход лучше с нормативной точки зрения, поскольку производители могут уже иметь профили безопасности продукта и характеристики, доступные для использования потребителями.

Существуют 3 основных уровня коммерческих систем: ручная, полуавтоматическая и полностью автоматизированная [14][15]. По мере увеличения уровня автоматизации возрастает и стоимость эксплуатации, при этом ручные методы обходятся дешевле, чем автоматизированные или полуавтоматические системы; тем не менее по мере увеличения автоматизации от технического специалиста требуется меньше навыков. Ручные методы требуют использования стандартного лабораторного оборудования (например, центрифуга, лабораторный шейкер с подогревом, кожух биозащиты) и хорошо обученный персонал для выполнения каждого шага процесса. Полуавтоматические системы требуют некоторого вмешательства персонала во время процесса выделения, но этот процесс упрощается за счет специального устройства, которое может автоматически выполнять несколько этапов процесса выделения. Полностью автоматизированные системы практически не требуют вмешательства пользователя и содержат все необходимое оборудование для проведения полного выделения СВФ в рамках единой закрытой системы. Обычно от персонала требуется только ввести в систему липоаспират и ферменты диссоциации тканей, и устройство будет проводить весь процесс выделения. Существуют системы выделения в различных ценовых диапазонах, чтобы удовлетворить потребности и финансовые возможности различных лабораторий и клиницистов; однако лаборатории и клиники должны знать, что результаты различных систем выделения могут значительно отличаться [16][17][18].

При проведении терапии в клинических условиях с использованием СВФ инфекционный контроль является наиболее важной мерой контроля качества с точки зрения обеспечения безопасности пациентов. Два основных теста, которые необходимо провести для оценки стерильности образца для введения человеку, — это окрашивание по Граму и культуры аэробных и анаэробных бактерий [19][20]. Введение терапевтического продукта не должно продолжаться до тех пор, пока результаты окрашивания по Граму не будут отрицательными. Если получен положительный результат окрашивания по Граму, что означает наличие бактерий, процедура не должна продолжаться. В случае положительного результата аэробной или анаэробной культуры за субъектом следует внимательно следить на предмет признаков инфекции [21].

Тестирование на бактериальный эндотоксин также имеет жизненно важное значение с точки зрения оценки безопасности образцов СВФ [22]. Бактериальные эндотоксины — это липополисахариды, присутствующие в клеточной мембране грамотрицательных бактерий, которые потенциально могут вызывать лихорадку или инфекционное заболевание на достаточно высоких уровнях концентрации [23]. Максимально безопасное количество эндотоксинов, которое может присутствовать в образце, известно как предел обнаружения эндотоксинов [24]. Предел обнаружения эндотоксина определяется в зависимости от веса пациента, объема образца и метода введения. Общая глава фармакопеи США (USP) <85> содержит полные инструкции по определению предела обнаружения эндотоксина, разрешенного Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) и Европейским агентством по лекарственным средствам (EMEA) (USP <85>) [25]. Повышенный уровень эндотоксина может быть индикатором серьезного бактериального загрязнения образца во время процесса выделения. Кроме того, в СВФ будут присутствовать эндотоксины в результате использования протеолитических ферментов, поскольку ферменты обычно имеют бактериальное происхождение. В конечном лиофилизированном продукте остаются остаточные уровни эндотоксина в результате производственного процесса. Ведущим анализом, используемым для оценки уровня бактериального эндотоксина, является анализ, основанный на использования реактива, представляющего собой лизат клеток крови (амебоцитов) мечехвоста Limulus polyphemus (ЛАЛ-реактив) [26].

Подсчет ядерных клеток и оценка их жизнеспособности имеют решающее значение для правильного приготовления дозы. Выделение СВФ варьируется первую очередь из-за вариабельности пациента. Для «рабочего образца» СВФ необходимо выделить минимальное количество жизнеспособных ядерных клеток, жизнеспособность которых выше определенного уровня (обычно ≥70 %) [27]. Если выделение СВФ не соответствует заранее определенным критериям выпуска партии образцов, то терапию не следует начинать или продолжать. Количество ядерных клеток и жизнеспособность клеток являются показателями эффективности процесса выделения и будут использоваться для обеспечения точного дозирования. Очень важно знать средний выход клеток (количество ядерных клеток на грамм ткани), поскольку разные методы и/или системы могут давать разные результаты [14][15].

Проточная цитометрия позволяет идентифицировать количество различных типов клеток, присутствующих в конечном продукте. Для СВФ, поскольку это гетерогенная популяция клеток, это важно, поскольку существуют значительные различия между методами выделения СВФ. Целью проточной цитометрии является определение пропорций различных типов клеток, содержащихся в СВФ, и, что наиболее важно, содержания СКЖТ (обычно <2 %) [28]. Обычно маркерами для проверки клеточной популяции в СВФ являются кластеры дифференцировки (CD): CD31, CD34, CD45, CD90 и CD105, при этом популяция клеток-мишеней представляет собой клетки, которые имеют CD45–, CD31–, CD73+, CD90+ и CD105+ [29].

Если в методах по выделению СВФ используются протеолитические ферменты, такие как коллагеназа, есть вероятность риска наличия остаточных протеолитических ферментов в конечном продукте. Токсичность остаточных ферментов в отношении клеточной популяции СВФ до конца не изучена, но теоретически может привести к аллергической реакции или нежелательной деградации ткани in vivo, если ее не удалить надлежащим образом (см. тестирование на бактериальный эндотоксин) [30]. Уровень остаточного фермента можно измерить с помощью ряда различных анализов, но наиболее распространенным является анализ, основанный на использовании субстрата N-[ 3-(2-furyl) acryloyl ]-Phe-Gly-Gly (FAPGG) [31]. Хотя это не обязательно проводить при каждом выделении образцов СВФ, важно продемонстрировать на достаточно большом размере выборки, что уровень протеолитических ферментов, присутствующих в конечном продукте, настолько низок, что они не являются клинически значимыми и не представляют значительного риска.

Анализ колониеобразующих единичных фибробластов (КОЕф) является эффективным и точным методом для количественного определения количества СКЖТ в образце СВФ [32]. Этот анализ позволяет оценить количество колоний, образовавшихся после культивирования, что является общим показателем частоты и свойств роста СКЖТ. Анализ КОЕф, проводимый в тандеме с панелью проточной цитометрии с 6 CDмаркерами, дает точную оценку состава образца СВФ, как только набор данных станет достаточно большим [32]. Один из ярких примеров эффективности анализа КОЕф на СВФ был продемонстрирован в работе/протоколе Hicok и Hedrick [33].

За последние десятилетия достигнут значительный прогресс в изучении биологии опухолей, изучении механизмов контроля метастазирования опухолей, апоптоза, инвазии, ангиогенеза и пролиферации опухолевых клеток. Эти данные были получены при изучении клеточного состава и микроокружения опухолей, различных внутриклеточных путей передачи сигналов, молекулярных процессов онкогенеза [34]. На сегодня проводится множество доклинических и клинических исследований по применению стволовых клеток (МСК и СКЖТ) для лечения некоторых заболеваний человека [35]. Однако до сих пор нет достаточных оснований для того, чтобы признать введение СВФ или СКЖТ абсолютно безопасным. В частности, существуют работы in vitro и in vivo, что некоторые типы клеток из популяции СВФ способны провоцировать развитие, рост и прогрессирование опухолей [36][37][38].

Тропизм, или миграция, стволовых клеток (например, МСК и СКЖТ) к ложу опухоли изучен недостаточно хорошо, однако может иметь два диаметрально противоположных значения. В исследовании, проведенном в 2017 году Shammas и др., была показана возможность использования СКЖТ в качестве переносчика цитотоксических агентов в опухоль in vitro (клеточная линия SKBR3 (аденокарциномы молочной железы)) [39]. При этом проникновение стволовых клеток в ложе опухоли рассматривается как серьезная опасность — источник риска рецидива [40]. Однако результаты данного исследования показывают, что доставка лекарств с применением СКЖТ в качестве переносчика обходится без изменения клеточного фенотипа. После фотоактивации гибель соседних раковых клеток под воздействием препарата демонстрирует потенциал СКЖТ как средства доставки в терапии опухоли.

Ряд исследований показали, что зрелые адипоциты способны стимулировать опухолевые клетки рака груди. Белая жировая ткань рассматривается как эндокринный орган, способный секретировать гормоны, факторы роста и цитокины, такие как инсулин, лептин, адипонектин, фактор роста гепатоцитов (HGF) и инсулиноподобный фактор роста (IGF1). Эти адипокины являются не только важными компонентами метаболизма, но они также могут способствовать прогрессированию ближайшей опухоли. Однако, как уже известно, среди популяций клеток СВФ нет зрелых адипоцитов, что указывает на безопасность применения СВФ в этом отношении [41][42]. Lee и др. в своем исследовании изучили влияния СВФ и трансплантированного жира на рак груди in vivo [43]. Из результатов было видно, что изначальный объем опухоли, составлявший 43,6, 42,3, 48,7 и 42,4 мм3 в исходный момент времени, стал 6780, 5940, 6080 и 5570 мм3 через 8 недель в четырех исследовательских группах A, B, C и D соответственно (группа A — контроль; группа В — вводили 30 мкл СВФ; группа С — вводили 0,5 мл жира и 30 мкл физиологического раствора; группа D — вводили 0,5 мл жира и 30 мкл СВФ). Другими словами, по сравнению с исходными значениями сразу после введения трансплантата (СВФ и жировая ткань), группы A, B, C и D показали среднее процентное увеличение на 12 270, 12 610, 12 530 и 14 060 %. При контрольном обследовании через 8 недель после трансплантации не было обнаружено отдаленных метастазов ни в одной группе.

Известно, что СВФ при реконструктивных операциях после мастоэктомии является мощной добавкой, которая может увеличивать количество эпителиальных клеток-предшественников в тканях молочной железы [44]. Поскольку в предыдущих исследованиях упоминалось, что СКЖТ, обнаруженные в СВФ, являются потенциальным источником пролиферации, миграции и метастазирования клеток рака молочной железы, следует соблюдать осторожность при использовании СВФ в качестве добавки [45][46]. В исследовании Lee и др. было показано увеличение объема рака груди примерно на 14,6 % через 2 месяца по сравнению с контрольной группой. Однако, основываясь на данных о влиянии СВФ на рост соседней опухоли и выживаемости жирового трансплантата, полученных в результате данного эксперимента, следует провести дополнительные исследования с моделями, использующими жировой трансплантат после иссечения ткани рака молочной железы. К тому же изучение изменений результатов должно основываться на количестве клеток СВФ в зависимости от различных концентраций СВФ в смешанных инъекциях. Другими словами, использование СВФ и СКЖТ имеет особое значение для реконструкции после мастэктомии у пациенток с раком груди. Следовательно, в ближайшем будущем необходимо провести дополнительные доклинические исследования по оценке взаимодействия клеток СВФ и СКЖТ с более широким спектром типов опухолей. Есть веские аргументы в пользу того, что клинические исследования должны тщательно регулироваться и контролироваться на предмет результатов до тех пор, пока не будет лучше изучено канцерогенное действие клеток, полученных из жировой ткани.

СВФ представляет собой гетерогенную популяцию клеток, которые, взаимодействуя друг с другом, могут воздействовать на процессы регенерации, ангиогенеза и иммуномодуляции. Однако конкретные механизмы синергетического взаимодействия клеток СВФ все еще требуют дальнейшего изучения. И хотя СВФ продемонстрировала хороший терапевтический эффект во многих исследованиях, все еще необходимо дальнейшее изучение, чтобы определить, имеются ли побочные эффекты данной терапии. Любая процедура в клинических условиях, включающая выделение и/ или использование СВФ, полученной из жировой ткани человека, должна сопровождаться максимальным контролем качества и безопасности. Также настоятельно рекомендуется проводить подсчет клеток и анализ жизнеспособности в каждом случае с использованием СВФ или ее отдельных клеток. Оценка влияния клеток СВФ на лечение различных заболеваний и травм, включая выживаемость клеток, скорость пролиферации и трансформации, а также определение характеристик трансформированных клеток, все еще требует изучения и решения в будущих исследованиях. Мы ожидаем, что в недалеком будущем появятся результаты исследований с исчерпывающими ответами, подтверждающие эффективность, качество и безопасность СВФ и ее использования для терапии в условиях рутинной клинической практики.