Легочный фиброз (ЛФ) является патологическим процессом, при котором паренхима легких замещается плотной соединительной тканью, происходит избыточное разрастание межклеточного матрикса, что ведет к диффузному или очаговому уплотнению органа, нарушению его гисто- и цитоархитектоники и к функциональной недостаточности [1][2]. Идиопатический легочный фиброз (ИЛФ) является интерстициальным заболеванием легких с неизвестной этиологией и неясным патогенезом, быстропрогрессирующим и не имеющим эффективного лечения [3].

За последние три года с появлением новой коронавирусной инфекции (COVID-19) значительно увеличилось число больных легочным фиброзом, а также пациентов с ИЛФ. Одним из самых грозных осложнений после перенесенной COVID-19 является легочный фиброз [2][4]. Пост-COVID-19 ЛФ характеризуется наличием стойкого легочного фиброза на компьютерных томограммах (КТ) и функциональными нарушениями после постинфекционного периода [2][4].

Считается, что этиопатогенез и прогрессирование ИЛФ тесно связаны с постоянным повреждением легочного эпителия и эндотелия различными факторами (сигаретный дым, токсины, химические вещества, вирусы), комплексным взаимодействием различных внутриклеточных сигнальных каскадов и дисфункцией между иммунными, эпителиальными и мезенхимальными клетками после активации фибробластов [1][5]. Поврежденные эпителиальные и эндотелиальные клетки активно экспрессируют TGF-β, который, в свою очередь, запускает TGF-β/Smad3-, Wnt/β- catenin, PDGF-сигнальные каскады и индуцирует эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) эндотелиально-мезенхимальный переход (ЭнМП). Эпителиальные и эндотелиальные клетки начинают продуцировать профиброгенные маркеры (α-гладкомышечный актин (α-SMA), фибробласт-специфический белок 1 (FSP1), коллаген 1 и фибронектин) и способны трансдиффенцироваться в фиброгенные миофибробласты [1][5]. Кроме того, пост-COVID-19 ЛФ может быть связан с активной секрецией альвеолярными макрофагами TGF-β, IL-8 и IL-1β, что также способствует ЭМП [1].

Из-за высокой смертности от ЛФ актуальна разработка новых методов лечения, основанных на выявлении биомаркеров и знании молекулярных механизмов заболевания. Получены данные о вкладе генов MUC5B, TERT, TERC, RTEL1, PARN, SFTPC, SFTPA2 в развитие ИЛФ [6]. Эпигенетические механизмы регуляции, такие как метилирование и ацетилирование ДНК и гистонов, миРНК также влияют на развитие и прогрессирование заболевания [7]. Особенный научный интерес представляют собой механизмы, так или иначе связанные с функцией длинных некодирующих РНК (днРНК), роль которых в возникновении и прогрессировании фибротических процессов в различных органах активно изучается [8]. Они представляют собой одноцепочечные РНК длинной более 200 пар оснований, осуществляющие регуляцию экспрессии генов, транскрипции, трансляции, созревания белков и многие другие функции, в том числе благодаря связыванию и ингибированию микроРНК (миРНК), которые, в свою очередь, ингибируют мРНК [9]. Имеются данные о роли некоторых днРНК в регуляции молекулярных сигнальных путей, связанных с развитием фиброза легких [10].

Целью исследования являлся анализ экспрессионного профиля длинных некодирующих РНК, вовлеченных регуляцию процесса активации фибробластов легких, трансдифференцировку и старение эпителиальных клеток (Н19, MALAT1, MEG3, DNM3OS, TP53TG1, LINC00342) в легочной ткани и мононуклеарных клетках крови больных с ИЛФ и пост-COVID-19 ЛФ.

Исследование проводилось в Башкирском государственном медицинском университете (Российская Федерация) в период с сентября 2022 по июль 2023 г. в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики и принципами Хельсинкской декларации. В продольном проспективном нерандомизированном исследовании участвовали 52 индивида: 1 — группа с ИЛФ (n = 12), 2 — с пост-COVID-19 ЛФ (n = 14), 3 — контрольная группа (n = 27). Все пациенты были госпитализированы в отделение торакальной хирургии клиники БГМУ. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом БГМУ, протокол № 3 от 21.09.2022. Все пациенты подписывали информированное согласие для участия в исследовании.

Диагноз ИЛФ устанавливался в соответствии с клиническими рекомендациями ATS, ERS, JRS, ALAT (American Thoracic Society, European Respiratory Society, Japanese Respiratory Society, Association Latinoamericana de Torax) [11]. Диагностическими критериями ИЛФ, согласно клиническим рекомендациям, являются признаки интерстициального легочного фиброза (пневмонии), установленные на основании результатов компьютерной томографии высокого разрешения и биопсии легочной ткани. Пациенты с пост-COVID-19 ЛФ включались в исследование в случае персистирующего фиброза и функциональной дыхательной дисфункции при отсутствии признаков воспаления (повышение уровня биомаркеров и COVID-антител в сыворотке крови) не менее чем через 6 месяцев после основного заболевания [12].

Основным малоинвазивным методом для последующего гистологического и молекулярного исследования выбрана видеоторакоскопическая краевая резекция легкого [11]. С учетом функциональной возможностей подбирался однолегочный наркоз. При низких показателях дыхательной функции двулегочный наркоз с карбокситораксом. Всем пациентам проводилась стандартная видеоторакоскопическая операция с получением легочной ткани из двух участков краевой резекции с помощью линейной кассеты 45 и 60 мм для исследования.

Образцы легочной ткани и крови контрольной группы были получены от 27 пациентов отделения торакальной хирургии, перенесших операции по поводу травм грудной клетки, пневмоторакса. Характеристика исследуемых групп представлена в таблице 1.

В условиях стационара осуществлен сбор биологического материала для проведения исследования. Диагноз дополнительно подтверждали по результатам гистологического исследования. У всех участников исследования были собраны образцы цельной венозной крови и образцы легочной ткани, полученной после проведения трансторакальной или транстрахеальной биопсии легочной ткани, дополненной, при отсутствии противопоказаний, видеоторакоскопической биопсией легкого. Получен биоптат легочной ткани минимальными размерами и зафиксирован в растворе «Фиксатор IntactRNA» для стабилизации РНК. Изоляция мононуклеарных клеток (моноцитов и лимфоцитов) из цельной крови проводилась в градиенте плотности фиколла. Тотальная РНК выделена из мононуклеарных клеток и образцов тканей с использованием реактива и протокола TRIzol reagent, Invitrogen, UK (www.invitrogen.com) согласно протоколу производителя. Качество и количество матрицы РНК (в нг/мкл) оценивали на спектрофотометре «NanoDrop 1000» (ThermoScientific, http://www.thermoscientific.com/en/home.html) по поглощению при длине волны 260 нм. Качество РНК определялось анализом соотношения оптических плотностей А260/А280, которое должно находиться в интервале 1,8–2,0, также использовали значение соотношения оптических плотностей А260/А230 для выявления компонентов, содержащих фенольные кольца.

С использованием геномных баз данных KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) integrated database [https://www.kegg.jp/], TarBase v8.0 [https://dianalab.e-ce.uth.gr/html/diana/web/index.php?r = tarbasev8], Lncrna2target V3.0 [http://bio-annotation.cn/lncrna2target/browse.jsp] проведен предварительный биоинформационный анализ in silico для идентификации сети взаимодействующих мРНК, миРНК, LncRNA, вовлеченных в ключевые сигнальные каскады, связанные с развитием легочного фиброза: активацию фибробластов легких, трансдифференцировку и старение эпителиальных клеток. По результатам поиска для анализа были выбраны следующие гены длинных некодирующих РНК: TP53TG1 (ID: 11257) (TP53 target 1), LINC00342 (ID: 150759) (long intergenic non-protein coding RNA 342), H19 (ID: 283120) (H19 imprinted maternally expressed transcript), MALAT1 (ID: 378938) (metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1), DNM3OS (ID: 100628315) (DNM3 opposite strand/antisense RNA), MEG3 (ID: 55384) (maternally expressed 3).

Синтез кДНК проведен с использованием набора «MMLV RT kit» («Евроген», Россия, www.evrogen.ru) с использованием гексамерного рандомного праймера. Исследование экспрессии генов днРНК проведено на приборе StepOnePlus (Applied Biosystems, США) в формате 96-луночных планшетов в 25 мкл реакционной смеси, содержащей специфические праймеры и целевой флуоресцентный зонд фирмы «ДНК-Синтез» (Россия) и реагенты для ПЦР «qPCRmix-HS HighROX» («Евроген», Россия). В качестве эндогенного контроля использован ген домашнего хозяйства (B2M). Относительный уровень экспрессии оценивали с помощью ddСt метода [13]. В каждую реакцию включали отрицательный контроль. В качестве референсного образца использовали образцы контрольной группы, ПЦР для каждого образца повторяли трижды.

Статистический анализ был проведен при помощи программного обеспечения GraphPad Prism 9 Software (GraphPad Software, https://www.graphpad.com). Для представления данных использовали методы непараметрической статистики: данные представлены в виде «медиана (интерквартильный размах Q1; Q3)» или средних и стандартного отклонения (для нормально распределенных данных). Для сравнения групп всех трех групп был применен критерий Краскела — Уоллиса, для парного сравнения групп — U-критерий Манна — Уитни. Уровень p < 0,05 считался статистически значимым. Для оценки прогностической значимости оценки уровней экспрессии проводился ROC-анализ и сравнение полученных значений площади под кривой (AUC).

Установлено значимое снижение уровня экспрессии днРНК TP53TG1 у больных ЛФ (табл. 2). Так, в мононуклеарных клетках крови больных с ИЛФ показано снижение более чем в 2 раза (FCh = 0,4308, FR = –2,321, P = 0,0313) и у пост-COVID-19 ЛФ более чем в 5 раз (FCh = 0,1888, FR = –5,293, P = 0,0003). В легочной ткани значимое снижение уровня экспрессии днРНК TP53TG1 более чем в 5 раз было показано у больных с пост-COVID-19 ЛФ (FCh = 0,1791 FR = –5,584, P = 0,0237). У больных ИЛФ также отмечено подавление экспрессии днРНК TP53TG1 в легочной ткани (FCh = 0,2617, FR = –3,821, P = 0,3008), но результаты были статистически не значимы (табл. 2).

С другой стороны, в группах больных ЛФ выявлено значимое повышение экспрессии днРНК MALAT1 в мононуклеарных клетках крови: у больных ИЛФ в 3 раза (FCh = 3,207, P = 0,0005) и пост-COVID-19 ЛФ почти в 10 раз (FCh = 9,854, P = 0,0003). В легочной ткани уровень экспрессии данной днРНК был сопоставим с таковым у группы сравнения.

Уровень экспрессии днРНК LINC00342 был более чем в 2 раза выше у больных ИЛФ в мононуклеарных клетках крови (FCh = 2,221, P = 0,0309).

Нами установлено значимое, в 10 и более раз, увеличение экспрессии днРНК DNM3OS в мононуклеарных клетках крови (FCh = 12,899, P = 0,0016) и легочной ткани (FCh = 9,527, P = 0,0001) больных ИЛФ.

Для днРНК со значимыми различными уровнями экспрессии в группах больных был проведен ROC-анализ. При разделении группы ИЛФ с контролем по уровню экспрессии днРНК TP53TG1 в мононуклеарных клетках крови площадь под ROC-кривой AUC = 0,7038 (95 % ДИ 0,5508–0,8568, P = 0,0321), оптимальная точка отсечения групп по уровню TP53TG1 составила 1,143 (чувствительность 0,818 и специфичность 0,597).

При разделении группы пост-COVID-19 ЛФ с контрольной группой по уровню днРНК TP53TG1 в мононуклеарных клетках крови AUC = 0,8403 (95 % ДИ 0,7448–0,9358, P = 0,0006, оптимальная точка отсечения 0,628, чувствительность = 1,0, специфичность = 0,709) и в легочной ткани AUC = 0,7279 (95 % ДИ 0,5607–0,8951, P = 0,0241, оптимальная точка отсечения 0,6506, чувствительность = 0,714, специфичность = 0,571).

Предиктивная значимость оценки уровня экспрессии днРНК MALAT1 в мононуклеарных клетках крови при разделении группы пост-COVID-19 ЛФ с контрольной группой составила AUC = 0,8187 (95 % ДИ 0,7005–0,9276, P < 0,001, оптимальная точка отсечения 2,064, чувствительность = 0,833, специфичность = 0,772); для разделении группы ИЛФ и контроля AUC = 0,8421 (95 % ДИ 0,7417–0,9425, P = 0,001, оптимальная точка отсечения 1,753, чувствительность = 0,889, специфичность = 0,719).

Установлена высокая прогностическая значимость оценки уровня экспрессии днРНК DNM3OS в мононуклеарных клетках крови (AUC = 0,9133, 95 % ДИ 0,7541–1,0000, P = 0,0035, точка отсечения 3,81, чувствительность = 1,00, специфичность = 0,933) и ткани легкого (AUC = 0,9091, 95 % ДИ 0,8022–1,0000, P < 0,001, точка отсечения 1,489, чувствительность = 0,90, специфичность = 0,772) для дифференциации групп ИЛФ и контрольной группы.

Для днРНК MEG3 и H19 уровень экспрессии у больных был сопоставим с таковым в контрольной группе.

Легочный фиброз — заболевание, характеризующееся необратимым ремоделированием легочной интерстициальной ткани, которое сопровождается нарушением дыхательной функции. Среди заболеваний, ассоциированных с идиопатической интерстициальной пневмонией, ИЛФ является наиболее агрессивным и имеет самую высокую заболеваемость и самый плохой прогноз с медианой выживаемости 2–4 года после постановки диагноза [1][2]. По оценке Всемирной организации здравоохранения, пандемия COVID-19 приведет к резкому росту заболеваемости ЛФ [4]. Механизмы, запускающие ЛФ и приводящие к его быстрому прогрессированию, остаются во многом неопределенными.

В последние несколько лет некодирующие РНК оцениваются учеными как возможность открытия новых терапевтических стратегий и определения биомаркеров сложных заболеваний [8][10]. Учитывая роль днРНК TP53TG1, LINC00342, H19, MALAT1, DNM3OS и MEG3 как регуляторов сигнальных путей, связанных с активацией фибробластов и ЭМП, мы проанализировали уровень экспрессии выбранных днРНК у пациентов с ЛФ.

В настоящем исследовании нами показано, что уровень относительной экспрессии MALAT1 был значительно повышен в мононуклеарах крови больных ЛФ, а в группе больных пост-COVID-19 ЛФ наблюдалось 10-кратное увеличение экспрессии MALAT1. Результаты анализа ROC-кривых показали высокую прогностическую значимость оценки уровня экспрессии MALAT1 в мононуклеарах крови для дифференциации пациентов с ЛФ, в том числе с ИЛФ и пост-COVID-19 ЛФ, от здоровых лиц. Доказана ключевая роль MALAT1 в регуляции широкого спектра генов, вовлеченных в сигнальные пути TGF-β1/Smad2/3-, PI3K/AKT/mTOR- и связанных с модуляцией ЭМП, воспаления в легочной ткани и воспаления при SARS-CoV-2 [14]. Вклад MALAT1 в развитие заболеваний легких в настоящее время находится в стадии изучения. Экспрессия MALAT1 была повышена в макрофагах, обработанных липополисахаридом (ЛПС), при фиброзе легких [15]. Wang et al. также наблюдали значительное повышение уровня экспрессии MALAT1 в периферической крови у пациентов с ИЛФ [16].

Нами установлено значимое снижение уровня экспрессии днРНК TP53TG1 в мононуклеарах крови и легочной ткани больных ЛФ. Наиболее выраженное снижение уровня экспрессии TP53TG1 наблюдалось у пациентов с пост-COVID-19 ЛФ. Полученные результаты ROC-анализа продемонстрировали высокую прогностическую способность оценки уровня экспрессии днРНК TP53TG1 в мононуклеарах крови для дифференциации пациентов с пост-COVID-19 ЛФ от здорового контроля. Известно, что днРНК TP53TG1 выступает в качестве проапоптотического фактора в клетках легких, участвуя в регуляции оси hsa-mir-18a-5p/PTEN [17]. Кроме того, было показано, что TP53TG1 выступает в качестве регулятора актина альфа 2 гладких мышц (ACTA2), фибронектина 1 (FN1), коллагена 1α1, коллагена 3α, коллагена I [17]. Повышение экспрессии TP53TG1 снижает уровень блеомицин индуцированной экспериментальный ЛФ у мышей [18]. Результаты нашего исследования согласуются с ранее полученными данными и также демонстрируют значительное снижение экспрессии TP53TG1 у пациентов с ЛФ, что свидетельствует об участии этой днРНК в патогенезе ЛФ.

Согласно полученным результатам уровень экспрессии DNM3OS в мононуклеарах крови и легочной ткани значительно повышается у больных ИЛФ. Показана высокая диагностическая значимость оценки уровня экспрессии DNM3OS как предиктора развития ИЛФ. ДнРНК DNM3OS участвует в регуляции легочного воспаления и функционирует как профибротический и антиапоптотический фактор [19]. В то же время было показано, что DNM3OS функционирует как регулятор SMAD-опосредованного (SMAD4, SMAD2, p-SMAD2) и SMAD-независимого (p-Akt, Akt, p-GSK-3β, GSK-3β) путей трансдукции профибротического сигнала, опосредованного TGF-β1 [19]. Savary et al. продемонстрировали, что DNM3OS в фибробластах легких фрагментируется на три миРНК (miR-199a-5p, miR-199a-3p и miR-214–3p), которые связаны с сигнальным путем TGF-β [19]. DNM3OS способен регулировать взаимодействие между профибротическими TGF-β и Wnt сигнальными путями [19].

Нами установлено увеличение уровня экспрессии днРНК LINC00342 в мононуклеарах больных ИЛФ. По результатам ROC-анализа было выявлено, что уровень экспрессии LINC00342 обладает умеренной прогностической способностью для дифференциации лиц с ИЛФ (AUC = 0,7136) от здоровых индивидов. LINC00342 связывается с miR-203a-3p и подавляет антионкогенную активность белков p53 и PTEN, а miR-203a-3p функционирует как регулятор сигнального пути TGF-β/Smad3 и способствует TGF-β1-индуцированной ЭМП [20].

В заключение следует отметить, что в нашем исследовании впервые проведен анализ экспрессии днРНК (TP53TG1, LINC00342, H19, MALAT1, DNM3OS и MEG3) в мононуклеарах периферической крови и образцах легочной ткани пациентов с пост-COVID-19 ЛФ. Установлен сходный профиль экспрессии днРНК TP53TG1 и MALAT1 в мононуклеарах периферической крови больных пост-COVID-19 ЛФ и ИЛФ. Повышение уровня экспрессии DNM3OS в мононуклеарах периферической крови и легочной ткани, а также LINC00342 в мононуклеарах периферической крови установлено только у больных ИЛФ.

Согласно полученным результатам можно предположить, что профиль экспрессии TP53TG1, LINC00342, MALAT1 и DNM3OS в мононуклеарах периферической крови и легочной ткани может быть использован в качестве информативного и неинвазивного биомаркера пост-COVID-19 ЛФ и ИЛФ. Необходимы дальнейшие исследования уровня экспрессии широкого спектра некодирующих РНК, в том числе микроРНК и днРНК, для оценки их вклада в молекулярный патогенез легочного фиброза, что в перспективе позволит увеличить эффективность диагностики и прогноза легочного фиброза различной этиологии для определения оптимальной тактики лечения.

Информация о конфликте интересов. Конфликт интересов отсутствует.

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Информация о спонсорстве. Исследование было выполнено при поддержке гранта РНФ, договор № 22-25-00019 от 16.12.2021 г.

Sponsorship data. The study was carried out with support from the Russian Science Foundation, Contract No. 22-25-00019 dated 16.12.2021.

Благодарности. Мы выражаем благодарность всем пациентам за участие в данном исследовании.

Acknowledgments. We are grateful to all patients for their participation in this study.

Статья написана к I Евразийскому конгрессу торакальных хирургов, 11–13 декабря 2023 г., Уфа.

This article was prepared for the 1st Eurasian Congress of Thoracic Surgeons, December 11–13, 2023, Ufa.