Уровень эксцизионных колец Т-клеточного рецептора и κ-делеционного элемента В-клеток у пациентов с I–III стадиями рака яичников

ВВЕДЕНИЕ

Среди онкогинекологических новообразований рак яичников (РЯ) остается одной из основных причин летальности [1]. Известно, что обнаружение РЯ на ранней стадии значительно улучшает показатели общей выживаемости, но, тем не менее, у большинства пациенток даже после радикального лечения наблюдаются рецидивы заболевания [2]. Таким образом, сохраняется потребность в выявлении биомаркеров, которые позволят обнаруживать РЯ на ранней стадии и оценить прогноз заболевания [3].

В канцерогенезе важная роль отводится процессу накопления мутаций, которые происходят в результате сложных процессов эволюции опухолевой клетки. Мутации, накопленные в опухолевых клетках, способствуют экспрессии неоантигенов, что ведет к активации иммунной системы [4]. Активация противоопухолевого иммунитета зависит от разнообразия антигенов, которая определяется мутационной нагрузкой (TMB) [5][6]. По результатам доклинических и клинических исследований было обнаружено, что при злокачественных новообразованиях (ЗНО) маркером эффективности иммунотерапии и формирования специфического противоопухолевого иммунитета является ТМВ [7–14]. Известно, что терапия иммуноонкологическими препаратами РЯ эффективна только у отдельных пациенток. РЯ относится к так называемой «холодной опухоли» с низким уровнем мутационной нагрузки [15][16]. При раке яичников медиана TMB составляет 3,6 мутаций/Mb [17].

Важно отметить, что у 20–30 % пациентов с РЯ в генах репарации определяются герминальные или соматические мутации [18–20], которые отвечают за стабильность гена и будут определять вероятность формирования неоантигенов.

На этапах развития РЯ происходит постоянное взаимодействие между антигенами раковых клеток и иммунной системой. Отмечалось, что раковые клетки генетически нестабильны и для них характерна неконтролируемая пролиферация с гиперэкспрессией неоантигенов, которые могут быть распознаны иммунной системой [4]. При этом опухолевые антигены могут быть представлены сверхэкспрессируемыми нормальными белками и белками, образующимися в результате мутаций и перестроек генов [21][22]. Формирующиеся неоантигены способствуют запуску специфического противоопухолевого иммунитета [23][24] и определяют вероятность иммунного надзора над опухолью. Вероятность формирования комплементарных связей между рецепторами иммунокомпетентных клеток и опухолевыми антигенами зависит как от TMB, так и от разно­образия Т-клеточных рецепторов (TCR) [23].

Исходя из важности иммунного надзора над опухолью следует отметить неоценимую роль иммунной системы в обнаружении опухолевых антигенов и последующее уничтожение злокачественных клеток [23]. Неоантигены являются основными мишенями для формирования противоопухолевого иммунитета [24–26]. У больных РЯ разрушение опухолевой ткани ведет к повышению антигенной нагрузки, но при этом происходит активация механизма иммуносупрессии. Необходимо отметить, что кроме TMB и антигенной нагрузки важная роль в формировании специфического противоопухолевого иммунитета отводится разнообразию TCR. Созревание Т- и В-лимфоцитов сопровождается V (D)J-рекомбинацией участков ДНК, которая имеет ключевую роль в формировании различных вариантов TCR и В-клеточных рецепторов (BCR) [23]. Во время каждой такой рекомбинации происходит вырезание небольшого фрагмента ДНК, в результате чего образуются эксцизионные кольца. В процессе формирования TCR вырезанные фрагменты ДНК образуют эксцизионные кольца рекомбинации Т-клеточных рецепторов, которые экспортируются в цитоплазму Т-клеток [24]. На этапе формирования ВCR формируются эксцизионные кольца рекомбинации В-клеточных рецепторов [23][24]. Маркером разнообразия рецепторов иммунокомпетентных клеток к антигенам являются эксцизионные кольца Т-клеточного рецептора (TREC) и κ-делеционного элемента В-клеток (KREC), которые относятся к внехромосомным структурами ДНК [23][24].

Целью данной работы явилось исследование уровня эксцизионных колец рекомбинации T-клеточных и В-клеточных рецепторов у пациенток с I–III стадиями рака яичников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование вошли 42 пациентки, находящиеся на лечении в ГАУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер» Минздрава Республики Башкортостан. Пациентки проходили лечение по поводу первичного рака яичников. Возрастной интервал составлял от 23 до 74 лет. Средний возраст пациенток — 55,4 года.

В возрасте от 18 до 24 лет в исследование вошла 1 пациентка (2,4 %), в возрастную группу от 25 до 44 лет — 8 (19 %) пациенток, от 45 до 60 лет — 15 (35,7 %), старше 60 лет — 18 (42,9 %). Основную долю составили пациентки c III стадией рака яичников — 28 (66,7 %), на II стадии было 6 (14,3 %), на IС стадии — 8 (19,0 %). Всем пациенткам в соответствии с клиническими рекомендациями после радикального хирургического лечения назначена адъювантная химиотерапия. Проводилось по 6 курсов химиотерапии препаратом паклитаксел в дозе 175 мг/м² в комбинации с карбоплатином AUC6 с частотой 1 раз в 21 день. После курсов адъювантной терапии пациентки находились на динамическом наблюдении.

До начала противоопухолевой лекарственной терапии оценивали общий анализ крови, биохимический анализ крови, коагулограмму. Перед началом химиотерапии для оценки уровней TREC и KREC однократно осуществлялся забор венозной крови в вакуумную пробирку.

Для экстракции РНК и ДНК из клинических образцов применялись реактивы из набора «РИБО-преп». Оценка уровня TREC и KREC осуществлялась с использованием набора реагентов «ИММУНО-БИТ» («АБВ-тест», Россия) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). В работе применялся анализатор: амплификатор Real-time CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США), детектирующий амплификатор ДТ-96 («ДНК-Технология», Россия). Аналитическая чувствительность тест-системы составляет 1×10³ копий/мл. Аналитическая специфичность тест-системы составляет 100 %.

Статистический анализ проводился с использованием программы StatTech v. 4.5.0 (разработчик — ООО «Статтех», Россия). Количественные показатели оценивались на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро — Уилка. Количественные показатели, имеющие нормальное распределение, описывались с помощью средних арифметических величин (M) и стандартных отклонений (SD), границ 95 % доверительного интервала (95 % ДИ). В случае отсутствия нормального распределения количественные данные описывались с помощью медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (Q1–Q3).

Категориальные данные описывались с указанием абсолютных значений и процентных долей. 95 % доверительные интервалы для процентных долей рассчитывались по методу Клоппера — Пирсона. С помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена оценивались направление и теснота корреляционной связи между двумя количественными показателями.

С помощью метода линейной регрессии разрабатывалась прогностическая модель, характеризующая зависимость количественной переменной от факторов. По методу Каплана — Мейера проводилась оценка функции выживаемости пациентов.

По методу регрессии Кокса проводился анализ выживаемости пациентов. Для оценки диагностической значимости количественных признаков при прогнозировании исхода заболевания применялся метод анализа ROC-кривых. Разделяющее значение количественного признака в точке cut-off определялось по наивысшему значению индекса Юдена. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

После установки диагноза пациенткам в соответствии с клиническими рекомендациями проводилось хирургическое лечение с последующей адъювантной терапией.

До начала терапии в общей популяции 42 пациенток медиана уровня эксцизионных колец Т-клеточного рецептора (TREC, копий/10⁵ клеток) составила 16,04 [ Q1–Q3: 2,14–37,31], медиана уровня κ-делеционного элемента рецептора В-клеток (KREC, копий/10⁵ клеток) составила 130,06 [ Q1–Q3: 0,34–917,00] (табл. 1).

По данным, представленным в таблице 1, отмечается широкий диапазон уровня TREC от 0,05 до 345,8 копий/10⁵ клеток, что может свидетельствовать о разном состоянии Т-клеточного иммунитета у пациенток. Показатели KREC у пациенток определены от 0,34 до 917,00 копий/10⁵ клеток, что также может свидетельствовать о наличии гуморального иммунодефицита среди некоторых пациенток.

После радикального лечения у 17 пациенток (40,5 %) констатирован рецидив заболевания. Медиана безрецидивной выживаемости составила 19 месяцев, самый ранний рецидив зарегистрирован через 7 месяцев от начала лечения.

Был проведен анализ уровня TREC в группах пациенток с рецидивом рака яичников и без рецидива (табл. 2).

По результатам определения уровня TREC между группами пациенток с рецидивом и без рецидива статистически значимых различий не выявлено (p = 0,155). Представленные результаты демонстрируют, что у пациенток, рецидивировавших после радикального лечения, наблюдается более низкий уровень медианы TREC, который может свидетельствовать о Т-клеточном иммунодефиците.

Вероятность развития рецидива в зависимости от уровня TREC определяли методом ROC-анализа. Площадь под ROC-кривой составила 0,631 ± 0,087 [ 95 % ДИ: 0,461–0,800]. Полученная модель не была статистически значимой (p = 0,155).

Пороговое значение TREC в точке cut-off (пороговое значение), которому соответствовало наивысшее значение индекса Юдена, составило 13,92. Рецидив прогнозировался при значении TREC ниже данной величины. Чувствительность и специфичность модели составили 64,7 и 72,0 % соответственно.

На следующем этапе исследования проводился анализ уровня TREC при различных стадиях рака яичников (табл. 3).

При сравнительной оценке уровня TREC при различных стадиях рака яичников статистически значимые различия не установлены (p = 0,908).

В последующем нами проводилось определение уровня KREC у пациенток с рецидивом и без рецидива рака яичников (табл. 4).

При оценке уровня KREC в группе пациенток с рецидивом и без рецидива рака яичников статистически значимых различий также не выявлено (p = 0,293). Но, тем не менее, представленные результаты демонстрируют, что у пациенток, рецидивировавших после радикального лечения, наблюдается более низкий уровень медианы KREC, который может свидетельствовать об иммунодефиците гуморального звена.

Вероятность развития рецидива в зависимости от уровня KREC определялась с помощью ROC-анализа. Под ROC-кривой площадь составила 0,596 ± 0,089 [ 95 % ДИ: 0,423–0,770]. Полученная модель не была статистически значимой (p = 0,293). Пороговое значение KREC в точке cut-off составило 75,940 копий/10⁵ клеток. Рецидив рака яичников прогнозировался при значении KREC ниже данной величины. Чувствительность и специфичность модели составили 47,1 и 84,0 %, соответственно.

В последующем при разных стадиях рака яичников проведено определение уровня KREC (табл. 5).

При разных стадиях рака яичников статистически значимых различий уровня KREC не было (p = 0,575).

Нами был проведен анализ TREC в зависимости от возраста пациенток (табл. 6).

В результате оценки уровня TREC в разных возрастных группах статистически значимых различий не выявлено (p = 0,437).

Результаты определения уровня KREC в разных возрастных группах представлены в таблице 7.

В разных возрастных группах в результате оценки уровня KREC статистически значимых различий не выявлено (p = 0,860).

Нами был выполнен корреляционный анализ с оценкой зависимости уровня TREC от возраста. При оценке связи TREC (копий/10⁵ клеток) и возраста была установлена слабой тесноты обратная связь (ρ = –0,227; p = 0,148). При увеличении возраста на 1 год следует ожидать уменьшение TREC на 1,746 копий/10⁵ клеток. Полученная модель объясняет 10,9 % наблюдаемой дисперсии TREC.

При оценке связи KREC и возраста также была установлена слабой тесноты обратная связь (ρ = –0,167; p = 0,292). При увеличении возраста на 1 год следует ожидать уменьшение KREC на 4,637 копий/10⁵ клеток. Полученная модель объясняет 6,3 % наблюдаемой дисперсии KREC.

ОБСУЖДЕНИЕ

На фоне адъювантной терапии у пациентов с прогрессированием заболевания отмечается более низкая медиана показателя эксцизионных колец Т-клеточного рецептора, что свидетельствует о снижении количества Т-лимфоцитов, т. е. наблюдается Т-клеточный иммунодефицит, который осуществляет главную надзорную функцию над опухолью.

Изменение иммунного профиля пациентов представляет собой ключевую составляющую процесса онкогенеза. Различные типы злокачественных новообразований часто приводят к угнетению естественной противоопухолевой активности иммунной системы, что существенно затрудняет ее способность противостоять канцерогенезу и организовать иммунный надзор над опухолью [22].

Это открытие имеет важное значение для понимания того, как изменения в клеточном иммунном ответе могут оказывать влияние на развитие рака и его течение. Дальнейшие исследования уровня TREC у пациенток с диагнозом рака яичников позволят выделить группу с иммунодефицитом и применять его как маркер прогрессирования заболевания.

В проведенном исследовании впервые были представлены результаты анализа уровня TREC у пациенток с I–III стадиями рака яичников, выявив при этом прогностическую значимость концентрации эксцизионных колец Т-клеточного рецептора. Это указывает на возможность использования этих маркеров для проведения оценок прогноза заболевания и выбора оптимальных методов лечения. Дальнейшие исследования в области иммуноонкологии имеют неоценимое значение и позволят глубже понять динамику изменений показателей TREC и KREC (которые отражают активность иммунных клеток) на протяжении курса лечения [27]. Оценка этих изменений может стать важным инструментом для прогнозирования результатов терапии и повышения показателей выживаемости пациентов, что, в свою очередь, должно привести к более целенаправленным и эффективным стратегиям в лечении злокачественных новообразований [23].

Современные методы терапии РЯ требуют более тщательного и глубокого анализа иммунологических взаимодействий, которые имеют место между опухолевыми клетками и иммунной системой [27–31]. В ходе данного исследования осуществляется попытка приблизить понимание иммунологических изменений, происходящих у пациенток в ответ на различные схемы противоопухолевой медикаментозной терапии. Важным аспектом работы является патогенетическое обоснование выбора тех или иных подходов, направленных на стимуляцию противоопухолевого иммунного ответа [22][23].

Терапевтические стратегии, применяемые в лечении РЯ, однозначно требуют учета взаимодействия между опухолью и иммунной системой, поскольку именно эти взаимодействия определяют как эффективность лечебных подходов, так и прогноз для пациенток. В этом контексте выявление маркеров, отражающих изменения в иммунном статусе, а также факторов, способствующих активации противоопухолевого иммунитета, играет решающую роль.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изменение иммунного статуса является неотъемлемой частью онкогенеза. На основании полученных нами результатов можно сделать вывод о том, что у больных РЯ с увеличением стадии наблюдается снижение в крови уровней TREC и KREC. Эти изменения отражают наличие иммунодефицитных состояний, что, в свою очередь, отражает снижение противоопухолевой защиты и усложняет борьбу организма с болезнью.

Важно отметить, что снижение уровня KREC и TREC наблюдается не только у отдельных групп пациенток, но и во всех возрастных категориях, что подчеркивает системный характер иммунных изменений.