Микро-РНК как новые игроки в контроле функций гипоталамуса

Введение

Сложность клеточных и молекулярных механизмов, которые участвуют в физиологии живых существ, явля­ется результатом длительного процесса эволюции, ос­нованного на естественном отборе и определяемого ре­продуктивным здоровьем людей. Половое размножение играет важную роль в эволюции, позволяя производить передачу генов следующему поколению и фиксацию признаков, благоприятствующих выживанию видов. У млекопитающих репродукция является тонко регу­лируемым процессом по оси гипоталамус—гипофиз— гонадотропин (ГПГ); он адаптируется как к колебани­ям внутренних параметров, таких как энергетическое состояние или биологические часы, так и к процессам окружающей среды, таким как цикл день/ночь, времена года, присутствие потенциального партнера. Сеть узко­специализированных нейронов, способных эффектив­но интегрировать всю эту информацию для координа­ции полового созревания, запуска полового созревания и контроля фертильности в зрелом возрасте, находится в гипоталамусе. Эта сеть гипоталамических нейронов сходится к нейронам, которые выделяют в кровь нейро­гормон — гонадотропин-рилизинг-гормон (ГнРГ) [1]. В гипофизе ГнРГ контролирует синтез и секрецию гона­дотропинов в кровотоке: лютеинизирующего гормона (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Эти два гонадотропина воздействуют на половые железы, яичники и яички, вызывая выделение половых стеро­идных гормонов: эстрадиола и тестостерона. Актив­ность нейронов ГнРГ важна для контроля за фертиль­ностью. ГнРГ является доминирующим регуляторным нейропептидом для размножения. Любое врожденное или функциональное нарушение, ведущее к дефициту или отсутствию секреции ГнРГ, приводит к нарушени­ям фертильности или даже бесплодию. Это особенно относится к врожденному гипогонадотропному гипо- гонадизму (ВГГ), редкому генетическому заболеванию, при котором отсутствие передачи сигналов ГнРГ в ги­поталамусе вызывает отсутствие полового созревания [2]. В последние десятилетия усилия научного сообще­ства по выяснению причин этого заболевания были сосредоточены на генетических исследованиях у па­циентов с ВГГ и функциональных исследованиях с ис­пользованием генетически модифицированных моде­лей грызунов. Многие гены были идентифицированы, но понимание механизмов, участвующих в гипотала- мическом контроле половой зрелости и репродукции, остается неполным. Одной из причин недостаточности знаний является то, что эти исследования были сосре­доточены на генах, кодирующих белок, и пренебрегли большим семейством генов, известных как некодирую­щие РНК, которые не кодируют белок, но чья степень и важность ничуть не меньше. Они могут быть неболь­шими, длиной примерно 20 нуклеотидов, известными как микро-РНК (miRNAs), или транскриптами длиной более 200 нуклеотидов, определяемыми как длинные некодирующие РНК (lncRNAs). Новые разновидности нкРНК продолжают идентифицироваться благодаря появлению новых технологий, таких как секвенирование РНК. Хотя еще не все функции нкРНК известны, их роль в управлении различными сложными механизма­ми больше не вызывает сомнений.

Биогенез и функция микро-РНК

Первым этапом биогенеза микро-РНК является транс­крипция с ДНК, которая, как правило, осуществляет­ся РНК-полимеразой II, тем же ферментом, который транскрибирует «стандартные» белок кодирующие гены. Более того, очень часто участки, кодирующие микро-РНК, находятся внутри белок кодирующих ге­нов. Таким образом, во многих случаях первичным продуктом может выступать обычная мРНК. Однако обычно РНК-транскрипт, служащий предшественни­ком микро-РНК, обозначают как pri-miRNA. Микро-РНК чаще закодированы в интронах, но экзон- локализованные микро-РНК также широко распростра­нены. Единственным обязательным критерием является наличие самокомплементарного участка, способного формировать шпильку на транскрибированной РНК. Такая структура pri-miRNA еще в ядре распознается и отрезается от остального транскрипта ферментным комплексом, включающим белки Drosha и Pasha. В каче­стве вспомогательных компонентов этого комплекса мо­гут присутствовать хеликазы3 и гетерогенные ядерные рибонуклеопротеиды (hnRNP). Менее распространен­ным путем является процессинг без участия комплекса, т.е. за счет механизма сплайсинга. Это происходит в тех случаях, когда область шпильки совпадает с границами вырезаемого интрона. Результатом процессинга pri-miRNA является фрагмент РНК длиной 60-70 нуклео­тидов, называемый pre-miRNA. Этот фрагмент содержит в своем составе двухцепочечный участок: две самоком- плементарные области, соединенные петлей (terminal loop), и небольшой одноцепочечный участок на З’-конце. Совокупность этих элементов распознает белок экспортин-5 в комплексе с малой ГТФазой Ran.

После образования комплекса Ran/ГТФ/экспортин-5/ примикро-РНК происходит его перенос через поры ядерной мембраны в цитоплазму. Здесь после гидролиза ГТФ комплекс распадается с высвобождением молеку­лы РНК [3]. Экспорт из ядра — это важный этап биоге­неза микро-РНК. В цитоплазме находятся структурные элементы pri-miRNA — двухцепочечная шпилька и ко­роткий неспаренный участок на ее конце, которые рас­познаются ферментом Dicer. Данный фермент имеет в своем составе домен PAZ (распознает неспаренный конец шпильки), двухцепочечный РНК-связывающий домен, хеликазный домен и два домена с активностью РНКазы III. После связывания и правильного позици­онирования Dicer на молекуле pri-miRNA РНКазные домены вносят два разрыва в РНК возле петли, отре­зая ее от шпильки. Образованный двухцепочечный РНК-продукт длиной около 22 нуклеотидов связы­вается белком Ago2 из семейства Argonaute. Ago2 сам по себе также обладает эндонуклеазной активностью и в случае некоторых микро-РНК может осуществлять процессинг примикро-РНК без участия Dicer. Из двух цепей РНК, образовавшихся после отщепления петли, только одна, называемая ведущей, остается связанной с Ago2, в то время как другая («пассажирская») дис­социирует от комплекса и, как правило, деградирует. Выбор ведущей цепи определяется структурой самого дуплекса: большую вероятность остаться в комплек­се с Ago2 имеет цепь, несущая неспаренный участок на своем 5’-конце. Комплекс Ago2 с единичной цепью РНК, а также белком GW182 обозначается как miRISC (miRNA-induced silencing complex).

RISC-комплекс в цитоплазме обеспечивает главный эффект микро-РНК — подавление экспрессии генов, мРНК которых имеет участок, комплементарный по­следовательности микро-РНК. Такие гены называются мишенями для данной микро-РНК. Важнейшим этапом в выборе мишени является распознавание в мРНК по­следовательности, которая была бы комплементарна со 2-го по 8-й нуклеотид микро-РНК. Последние об­разуют так называемую ключевую последовательность микро-РНК. Комплементарность между ключевой по­следовательностью микро-РНК и последовательностью мРНК обеспечивает посадку RISC-комплекса на мРНК- мишень. Чаще всего такие участки комплементарности в мРНК (сайты связывания микро-РНК) находятся в 3’-нетранслируемой области, т.е. после белок-кодиру- ющей части. Посадка RISC-комплекса на мРНК-мишень может иметь разные последствия, которые зависят в том числе и от степени комплементарности между микро-РНК и мРНК. В случае полной комплементар­ности включается РНКазная активность Ago2, который разрезает мРНК в месте посадки. Такая мРНК быстро расщепляется клеточными рибонуклеазами. Прочие механизмы подавления трансляции не требуют пол­ной комплементарности. В частности, рекрутирование белком GW182, CCR4-NOT и PAN2-PAN3, обеспечивая отщепление от мРНК поли-А-сигнала, а привлечение белков DCP1/2 ведет к удалению кэпа [4, 5]. В обоих случаях мРНК становится нефункциональной и в даль­нейшем деградирует. Наконец, само по себе нахождение RISC-комплекса на мРНК препятствует посадке и про­движению рибосомы. Следует отметить, что в отдель­ных случаях микро-РНК могут быть не репрессорами, а прямыми активаторами трансляции, однако распро­страненность такого «исключения» пока недостаточно изучена [6]. Таким образом, микро-РНК в составе RISC- комплекса осуществляют «выключение» экспрессии своих генов-мишеней, причем выбор мишеней опреде­ляется последовательностью микро-РНК, точнее, нали­чием комплементарной ей последовательности в мРНК. Одна и та же микро-РНК может воздействовать на все мРНК, имеющие в своей последовательности соответ­ствующие сайты связывания. Более того, поскольку для посадки RISC-комплекса не требуется полной ком­плементарности, эти сайты могут иметь слегка различа­ющиеся последовательности. Фактически микро-РНК являются исключительно универсальным механизмом подавления экспрессии и поэтому задействованы в ре­гуляции широкого спектра клеточных процессов (по разным оценкам, от 30 до 60 % генов человека являются мишенями микро-РНК) [7, 8].

Микро-РНК и центральная нервная система

Гены miRNAs могут быть расположены в межгенных последовательностях, в интронах или в экзонах кодиру­ющих генов, как и в некодирующих генах. Транскрип­ция гена miRNA может быть осуществлена с помощью РНК-полимеразы II-III и транскрибирована в простых единицах от своего собственного промотора или в бо­лее сложных молекулах из 2 или более микро-РНК (на­зываемых кластерами) от общего промотора. Исходный транскрипт (называемый pri-miRNA) имеет структуру CAP (английская кепка) на 5’ конце и хвост полиадени- нов на 3’ конце. Эта молекула свернута в форме вилки и распознается ферментами DROSHA и DGCR8, кото­рые обрезают концы, образуя самую короткую форму предшественника (~70-80 нуклеотидов), называемую pre-miRNA. Эти pre-miRNA экспортируются в цито­плазму благодаря действию фермента XPO5 и обра­батываются эндонуклеазой DICER1, что приводит к образованию функциональной двухцепочечной моле­кулы (18-25 нуклеотидов). Наконец, 2 нити разделяют­ся и включаются в мультипротеиновый комплекс RISC (РНК-индуцированный сигнальный комплекс), функ­ция которого состоит в том, чтобы направлять miRNA к их мРНК-мишени. Обе цепи (-5p и -3p) могут быть функционально релевантными независимо от их оби­лия и стабильности. Как только комплекс RISC-miRNA располагается в гене-мишени, происходит ингибирова­ние трансляции и/или деградации мРНК.

С момента их открытия многие микро-РНК были описаны как ключевые факторы развития и функци­онирования центральной нервной системы [9]. Неко­торые играют существенную роль в генезе и диффе- ренцировке нервных клеток (нейронов и глиальных клеток). Действительно, нейроны, астроциты и олиго- дендроциты, три основных типа клеток, присутству­ющих в центральной нервной системе, происходят из общего нейрального предшественника, который подвергся сложной программе последовательной дифференцировки. Транскрипционный комплекс REST (RE1-silencing transcription factor) необходим для ингибирования нейрональных генов в клетках (та­ких как астроциты или олигодендроциты). Увеличение miR-9 и miR-124 во время нейрональной дифференцировки, которое вызывает ингибирование элементов этого репрессорного комплекса, позволяет увеличить экспрессию нейрональных генов в будущие нейро­нальные клетки [10, 11]. Микро-РНК также участвуют в правильном функционировании зрелых нейронов. Они контролируют, помимо прочего, передачу нерв­ных импульсов на синаптическом уровне. Таким об­разом, miR-132, miR-134 и miR-138 могут контролиро­вать морфологию дендритов, играя очень важную роль в обучении и памяти [12]. Некоторые miRNA также, по-видимому, экспрессируются в определенных струк­турах мозга и в определенные периоды жизни [13-15].

Микро-РНК и фертильность

Первоначально сообщалось о вовлечении miRNAs в ги- поталамо-гипофизарно-гонадотропную ось в гонадах и гипофизе. Действительно, анализ различных моделей модифицированных мышей с целью изменения созре­вания микро-РНК на уровне гонад показал, что они не­обходимы для функционирования яичек и яичников. В частности, miRNAs участвуют в контроле экспрессии генов, необходимых для митотического деления, мейо- тического деления и постмейотической фазы сперма­тогенеза в яичке, а также в процессах стероидогенеза, овуляции и в развитии и функционировании желтого тела в яичниках [16, 17]. MiRNAs также контролиру­ют экспрессию и/или секрецию гонадотропинов (ЛГ и ФСГ) в гипофизе. Действуя на гонадотропные клет­ки, ГнРГ модифицирует экспрессию miRNAs, которые будут участвовать в регуляции передачи сигналов и се­креции ФСГ и ЛГ [18, 19]. Также в гипофизе экспрессия ЛГ контролируется miR-200, miR-429 и miR-7a2 [20, 21]. MiRNAs будут участвовать в центральном контроле по­лового созревания. Исследования широкой ассоциации генома (GWAS) на людях показали связь между воз­растом полового созревания и локусом lin28 — геном, ответственным за специфическое подавление miRNAs в семействе let-75 [22]. Ось let-7/lin28, уже известная своей ролью в стволовых клетках и в эмбриональном развитии, может поэтому участвовать в контроле по­лового созревания: эта гипотеза была подтверждена ис­следованиями транскрипционной экспрессии в гипота­ламусе крыс в период полового созревания [23].

Роль микро-РНК в нейронах ГнРГ

Половое созревание требует постнатального усиления экспрессии ГнРГ и активации нейронов ГнРГ под вли­янием нейронов, которые выделяют кисспептин в ме­таболическую среду [1, 24, 25]. Тем не менее, несмотря на усилия научного сообщества понять это, чрезвычай­но сложный и тщательно отрегулированный процесс полового созревания остается загадкой современной биологии. Исследования показали роль miRNAs в ней­ронах ГнРГ, используя генетически модифицированную модель мыши, чьи нейроны ГнРГ не экспрессируют фер­мент Dicer и, следовательно, не продуцируют зрелые miRNAs [26]. Таким образом, было продемонстриро­вано, что некоторые miRNAs являются ядром сложной генетической сети, которая контролирует увеличение постнатальной экспрессии ГнРГ и позволяет наступить половому созреванию.

miR-200/429 и miR-155 и их соответствующие цели, Zeb1 (Zinc finger E-box-binding homeobox 1) и Cebpb (CCAAT/enhancer-binding protein beta), контролируют баланс между ингибиторными и промоторными фак­торами генного промотора, кодирующего ГнРГ. Транс­крипционный фактор Cebpb, мишень для miR-155, свя­зывается с промотором ГнРГ и подавляет экспрессию генов. Фактор транскрипции Zeb1, мишень для miR- 200/429, тем временем ингибирует непосредственно ген ГнРГ, но также и некоторые его активаторы. Подавляя эти ингибиторы во время критической переходной фазы между младенческим и ювенильным периодом, miR-200/429 и miR-155 позволяют устойчиво увеличи­вать экспрессию ГнРГ, которая необходима для поло­вого созревания. Эффекты этой сложной генетической сети не ограничиваются контролем экспрессии ГнРГ. Zeb1 и Cebpb также будут отвечать за ингибирование рецептора кисспептина. Существует также тесное взаи­модействие между нейронами ГнРГ, их сетями фактора транскрипции miRNA и синтезирующими оксид азота нейронами гипоталамуса (NOs), которые передают ме­таболическую информацию нейронам ГнРГ и актив­ность которых увеличивается с ростом времени мини­полового созревания [26-28]. Подавление активности промотора ГнРГ с помощью Cebpb напрямую регули­руется NO [29]. Ингибирование синтеза фермента NO (синтазы) у мышей позволяет частично восстановить экспрессию ГнРГ в отсутствие miR-155 [26]. Таким об­разом, ингибируя эти процессы, miR-200/429 и miR-155 позволяют нейронам ГнРГ модулировать свою чув­ствительность к внешним сигналам во время постна- тального развития. Эти генные сети играют не только роль в инициировании полового созревания, но также и в поддержании фертильности в зрелом возрасте [26].

Заключение

Недавние результаты показали ключевую роль, кото­рую miRNAs играют в гипоталамическом контроле половой зрелости и фертильности. Они позволяют рассмотреть многие исследования, чтобы выяснить различные функции семейства некодирующих РНК. Необходимы дальнейшие исследования для определе­ния активности других miRNAs в нейронах ГнРГ и их роли в других клетках, составляющих сеть гипотала­муса, которая контролирует фертильность. Таким об­разом, будет очень интересно оценить участие микро- РНК в координации этих различных типов клеток, необходимых для полового созревания и поддержания фертильности. Внутренняя и внешняя среда организма влияет на механизмы эпигенетического контроля, осо­бенно те, в которых задействованы микро-РНК [30-38]. Поэтому создание молекулярных основ для модуляции экспрессии miRNA в соответствии с этими внутренни­ми и внешними параметрами (биологические часы, по­ловые гормоны, метаболический контекст, циркадный цикл, воздействие стресса, запахи и т. д.) представляет собой особенно важную задачу. Идентификация miR- 200/429 и miR-155 в качестве ключевых игроков в управ­лении экспрессии ГнРГ в начале полового созревания, а также открытие важности miR-7a, экспрессия которо­го также увеличивается в нейронах ГнРГ во время по­ловой зрелости в зависимости от функции гонадотроп­ной оси, имеет значение для здоровья человека [21, 26, 39]. С этой точки зрения необходимы новые исследова­ния, чтобы утвердить эти miRNAs как диагностические и терапевтические мишени для тяжелого врожденного или функционального дефицита ГнРГ в гипоталамусе. Поэтому лучшее знание miRNAs у людей может при­вести к новым терапевтическим стратегиям модуля­ции репродуктивной оси в случаях функционального дефицита (преждевременное или замедленное половое созревание, аменорея гипоталамического происхожде­ния) или получение контрацептивного эффекта.