Неолимфогенез и иммуногистохимическое исследование лимфатических узлов при раке молочной железы

Введение

Неолимфогенез — процесс образования и развития новых лимфатических узлов в постнатальном перио­де. По данным классических анатомических изданий, формирование лимфатической системы у человека завершается на этапе эмбриогенеза и все изменения сводятся к уменьшению количества, общей массы лим­фоидной ткани и ее активности. Вновь образованный лимфатический узел имеет единый сосуд — афферент­ный и эфферентный (в норме — 4-6 афферентных и 1 эфферентный сосуд). Наличие вновь образованных лимфатических узлов, по предварительным наблюде­ниям, свидетельствует о прекращении функциональ­ной активности первого анатомического этапа-барьера сторожевого лимфатического узла (СЛУ) на пути рас­пространения раковых клеток [1].

В норме различные лимфоидные структуры воз­никают лишь в процессе развития плода, однако при длительных хронических воспалительных процес­сах, длительно не заживающих ранах, аутоиммунных и онкологических заболеваниях обнаружено реактив­ное новообразование различных лимфоидных струк­тур [2, 3].

Исследования в области изучения постнатально ин­дуцированных лимфатических узлов (третичных лим­фоидных органов, лимфоидного неогенеза) ведутся в международном научном сообществе очень активно. Предполагается, что появление вновь образованных лимфатических узлов при злокачественных опухолях можно рассматривать с позиций сложных механизмов взаимодействия иммунной системы с опухолью и ее метастазами. В частности, в постнатальных индуци­рованных лимфатических узлах (ПНИЛУ) у онколо­гических больных выявлены изменения экспрессии генов, кодирующих определенные провоспалительные цитокины, хемокины и рецепторы, что может оказы­вать влияние на процесс распространения злокаче­ственных клеток [4].

Ранее проведенные нами исследования доказали, что постнатально сформированные лимфатические узлы могут служить источником биологических сигна­лов, активирующих противоопухолевые реакции им­мунитета и подавляющих распространение метастазирующих злокачественных клеток [5].

Так, сравнение профиля РНК, содержащихся в ткани ги­стологически нормальных и третичных лимфатических узлов, которые были обнаружены при исследовании операционного материала у больных раком молочной железы, показало повышенную экспрессию в ПНИЛУ генов, кодирующих рецепторы XCR1 и CYFIP2, цитокины TNFSF14 и CCL16, а также сниженную экспрессию лигандов хемокинов CXCL5 и CXCL12 [6]. Неопластические злокачественные новообразования во многих своих свойствах сходны со средой хрониче­ского воспаления, в том числе с хроническим течением самого воспаления. Тем не менее злокачественные опу­холи отличаются от хронического воспаления по од­ному существенному признаку, который, как считают некоторые ученые, может предотвратить образование третичных лимфоидных структур высокоиммуносупрессивного микроокружения опухоли [7]. Однако, со­гласно последним исследованиям независимых ученых по всему миру, ТЛС различных степеней организации встречается у пациентов с различными видами первич­ных и метастазирующих опухолей [8-19].

Существуют представления о том, что индукция неолимфогенеза может быть использована для протезиро­вания функции иммунной системы [20], а воздействие на состояние этих структур с использованием лекар­ственных средств или методов биотерапии может по­служить основой для создания новых подходов к лече­нию онкологических больных [21].

Для иммуногистохимического исследования были вы­браны антитела к основным иммунокомпетентным клеткам, реализующим в лимфатическом узле ключе­вые иммунные реакции.

Цель работы — определение экспрессии CD3, CD20, CD68 в нативных, сторожевых и постнатально инду­цированных лимфатических узлах аксиллярной зоны при раке молочной железы.

Материалы и методы

Объектом исследования являлись лимфатические узлы при раке молочной железы аксиллярной области со сто­роны поражения опухолью. В исследование включались пациенты с установленным диагнозом «рак молочной железы» в стадиях IIIA, IIIB, IIIC. Во время операции, на этапе выделения аксиллярных лимфоузлов, при по­мощи красителя метиленового синего производили де­текцию сторожевого лимфатического узла путем введе­ния контраста в околонодулярную клетчатку. Макропрепарат (молочная железа с аксиллярными лимфатическими узлами и сосудами в едином блоке), полученный после операции — мастэктомии с аксиллярной лимфодиссекцией, подвергался сонолиподе- струкции, так как эта методика позволяет детально ви­зуализировать структурные компоненты аксиллярного лимфатического коллектора.

После этапа сонолиподеструкции мы получили дета­лизированную карту лимфатических узлов и сосудов аксиллярной области. Введение контраста во время операции позволило нам выявить 3 группы лимфати­ческих узлов.

1. Нативные неизмененные лимфатические узлы (НЛУ). Полностью окрашенные метиленовым синим мы при­нимали за функционально активные, не измененные опухолевым процессом лимфатические узлы. Для них характерным было наличие нескольких (4-6) афферент­ных и одного эфферентного лимфатического сосуда.
2. Новообразованные, постнатально индуцированные лимфатические узлы (ПНИЛУ). Также были полностью окрашены метиленовым синим, как следствие, видимо, функционально активных и не задействованных в ме­тастатическом процессе. Отличительной характеристи­кой ПНИЛУ было наличие единого афферентного и эфферентного лимфатического сосуда.
3. Сторожевые лимфатические узлы (СЛУ). Окраше­ны метиленовым синим частично, по нашему мнению, за счет блокады сторожевого лимфатического узла метастатическими клетками опухоли. В отличие от натив­ных и новообразованных у сторожевых лимфоузлов количество отводящих лимфу сосудов было значитель­но больше, их количество коррелировало с задейство­ванными в метастатическом процессе лимфатическими узлами. Чем больше было выявлено лимфоузлов, бло­кированных метастазами, тем больше лимфатических сосудов мы визуализировали отходящими от стороже­вого лимфоузла.

Лимфатические узлы фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина, обрабатывали по стандарт­ной гистологической методике и заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 1 мкм, изготовленные на микротоме Leica RM 2235, Германия, окрашивали ге­матоксилином и эозином.

Для иммуногистохимического исследования исполь­зовали аппарат для иммуногистохимии «Бонд-Макс» (Bond-maX), Австралия. Цифровые изображения полу­ченной иммуногистохимической экспрессии получали посредством сканирования готовых гистологических микропрепаратов на цифровом сканере микропрепа­ратов Leica Aperio AT2 производства Германии. Работа по оценке экспрессии выполнялась с использованием программного обеспечения Digital Pathology. Исследованию подвергались готовые оцифрованные изображения иммуногистохимической экспрессии фиксированной панели антител CD3, CD20, CD68. Для оценки результатов иммуногистохимической реакции проводили подсчет экспрессированных клеток на 2000 клеток в 10 случайным образом отобранных полях зрения (при увеличении х40). Учитывали умеренное и выраженное иммуногистохимическое окрашивание. Сравнительное исследование проводили в следующих группах: (1) сторожевые лимфатические узлы; (2) на­тивные лимфатические узлы; (3) постнатально индуци­рованные лимфатические узлы.

Экспрессированные клетки считали по основным структурно-функциональным зонам лимфоузлов, по каждому маркеру в отдельности:

• кортикальный синус;
• промежуточный синус;
• паракортикальная зона;
• лимфоидные фолликулы.

В работе использовались антитела согласно протоколу фирмы-изготовителя Leica, страна-производитель Ве­ликобритания (табл. 1).

Для удобства визуализации чувствительности разных структурно-функциональных зон к исследованным маркерам использовали рандомную шкалу распределе­ния процентов по степени экспрессии антител (табл. 2).

Результаты и обсуждение

Результаты сравнительного иммуногистохимического исследования НЛУ СЛУ и ПНИЛУ показали, что содер­жание CD3, CD20, CD68 в различных структурах лим­фатических узлов имело принципиальные отличия, поэтому приводим последовательное описание этих осо­бенностей в тканях различных лимфатических узлов.

В ткани СЛУ CD3 Т-клетки локализовались преиму­щественно в паракортикальной зоне (рис. 1а). Экс­прессия CD20+ В-лимфоцитов выявлялись больше всего в лимфоидных фолликулах, чуть меньше в па- ракортикальной зоне, некоторое количество клеток встречалось в промежуточных синусах и единичные клетки выявлялись в кортикальном синусе (рис. 1б). В ткани НЛУ CD68+ макрофаги/гистиоциты локализо­вались преимущественно в промежуточных синусах, в краевом синусе их было значительно меньше. В пара­кортикальной зоне и лимфоидных фолликулах встре­чались единичные экспрессированные CD68⁺-клетки (рис. 1в).

В ткани НЛУ CD3+ Т-клетки локализовались преиму­щественно в паракортикальной зоне (рис. 2а). Экс­прессия CD20+ В-лимфоцитов выявлялись больше всего в лимфоидных фолликулах, чуть меньше в паракортикальной зоне, некоторое количество клеток встречалось в промежуточных синусах и единичные клетки выявлялись в кортикальном синусе (рис. 2б). В ткани НЛУ CD68+ макрофаги/гистиоциты локализо­вались преимущественно в промежуточных синусах, в краевом синусе их было значительно меньше. В пара­кортикальной зоне и лимфоидных фолликулах встре­чались единичные экспрессированные CD68⁺-клетки (рис. 2в).

В ткани ПНИЛУ CD3 Т-клетки выявлялась выражен­ная экспрессия в краевом и промежуточном синусах и паракортикальной зоне. В лимфоидных фолликулах экспрессировались 25 % CD3⁺-клеток (рис. 3а). Экс­прессия CD20+ В-лимфоцитов выявлялась больше всего в лимфоидных фолликулах, чуть меньше в паракорти­кальной зоне, среднее количество клеток встречалось в промежуточных синусах и кортикальном синусе (рис. 3б). В ткани НЛУ CD68⁺-макрофаги/гистиоциты локализовались преимущественно в промежуточных синусах, в краевом синусе их было значительно мень­ше. В паракортикальной зоне и лимфоидных фоллику­лах встречались единичные экспрессированные CD68+- клетки (рис. 3в).

Процентное соотношение экспрессий каждой из струк­турно-функциональных зон лимфоузлов переведено в степени экспрессии по трем группам лимфоузлов (табл. 3-5).

Таким образом, в результате проведенного исследова­ния получены данные по интерпретации иммуногистохимического профиля лимфатических узлов (на­тивных, сторожевых и постнатально индуцированных) при раке молочной железы.

Выводы:

1. В постнатально индуцированных лимфатических уз­лах отчетливо выявлена отличная от нативных и сторо­жевых лимфатических узлов экспрессия антител к ос­новным иммунокомпетентным клеткам, реализующих в лимфатическом узле ключевые иммунные реакции, что может указывать на повышенный функциональный статус новообразованных лимфоузлов.
2. Проведенное исследование демонстрирует высокий уровень антигенной стимуляции Т- и В-лимфоцитов в ПНИЛУ, а также указывает на возможную роль клеток макрофагального ряда в стимуляции неолимфогенеза и образования новых лимфоузлов.
3. Реализация данного научного проекта позволяет в дальнейших научных изысканиях заложить фунда­ментальные основы для исследований, посвященных постнатальным индуцированным лимфатическим уз­лам у онкологических больных. На основе полученных данных мы приблизились к выявлению ключевых бел­ков, задействованных в процессе формирования постнатально индуцированных лимфатических узлов.

Информация о конфликте интересов. Конфликт интересов отсут­ствует.

Информация о финансировании. Данная работа не финансировалась.