Экстракция некодирующих РНК из студенистого ядра межпозвоночного диска с последующим профилированием их экспрессии

Введение

Некодирующие РНК (нкРНК) относятся к молекулам рибонуклеиновой кислоты (РНК), которые не кодируют белок. Они охватывают огромное количество классов РНК и выполняют широкий спектр биологических функций, таких как регулирование экспрессии генов, защита генома от экзогенной ДНК и управление синтезом ДНК [1]. Одними из таких классов нкРНК, которые широко изучены, являются микро-РНК и длинные некодирующие РНК (днРНК). Микро-РНК являются эндогенными и некодирующими одноцепочечными РНК, состоящими из 18-22 нуклеотидов, которые ингибируют экспрессию генов, способствуя деградации их матричных РНК (мРНК)-мишеней или ингибированию трансляции [2]. Доказано, что микро-РНК играют существенную роль в различных биологических процессах, включая клеточный цикл, апоптоз, пролиферацию и дифференцировку клеток, регулируя экспрессию около одной трети всех генов человека [3]. Длинные некодирующие РНК представляют собой группу некодирующих РНК длиной более 200 нуклеотидов. Из-за своей длины цепочки нуклеотидов длинных некодирующих РНК обладают уникальной способностью принимать множество сложных вторичных и третичных структур, позволяя им выполнять специфические функции, такие как катализ, метаболизм и дифференцировка клеток [4]. Длинные некодирующие РНК не могут кодировать белок, но могут модулировать экспрессию генов на эпигенетических (например, метилирование ДНК, модификация гистонов), транскрипционных (например, рекрутирование транскрипционных факторов) и посттранскрипционных (например, регуляция стабильности микро-РНК и мРНК) уровнях [5, 6]. Все большее число исследований продемонстрировало дерегуляцию или аберрантную экспрессию микро-РНК и длинных некодирующих РНК при различных видах заболеваний, включая опухолевые процессы, воспалительные, сердечно-сосудистые и заболевания опорнодвигательного аппарата [7-9]. Результаты некоторых исследований показали, что данные нкРНК играют непосредственную роль в развитии дегенеративных процессов в межпозвоночном диске [10, 11]. Межпозвоночный диск имеет сложное строение. Он состоит из центрально расположенного студенистого ядра, окруженного фиброзным кольцом. Основные компоненты, присутствующие в нормальном студенистом ядре, — это коллагеновые волокна II типа, имеющие циркулярное расположение в богатом протеогликанами и гликопротеинами гидратированном матриксе (около 80 % воды от сухого веса) [12]. Клетки студенистого ядра (нотохордальные клетки) имеют длинные отростки, переплетающиеся между собой, формируя структуру, подобную синцитию. Фиброзное кольцо межпозвоночного диска состоит из фиброзного или волокнистого хряща, отличающегося большой прочностью. Поддержание всей структурной целостности хрящевого матрикса зависит целиком от хондроцитов. И хотя их масса невелика, они синтезируют тем не менее все биополимеры, из которых состоит хрящевой матрикс: коллаген, эластин, протеогликаны, гликопротеины и т. д. [13]. Дегенерация межпозвоночного диска может начинаться с различных отделов, в том числе со студенистого ядра, и ассоциируется с изменением его структуры и механических свойств. Дегенеративные изменения в межпозвоночном диске представляют собой каскад реакций, который начинается с изменений в локальном клеточном микроокружении студенистого или пульпозного ядра и прогрессирует до нарушения их структуры и функции. Несмотря на то что вовлеченные механизмы не до конца понятны, хорошо установлено, что апоптоз и пролиферация клеток студенистого ядра, нарушение внеклеточного матрикса (ВМ) и воспалительная реакция играют критическую роль в развитии дегенеративных процессов межпозвоночного диска [14]. Примечательно, что некоторые микро-РНК и длинные некодирующие РНК воздействуют на эти патологические процессы [15-23] (табл. 1). Существует множество протоколов выделения тотальной РНК и ее фракций, таких как микро-РНК и длинные некодирующие РНК, из различных клеточных линий и тканей, но получение высоких количественных и качественных показателей из определенных тканей, как в случае студенистого ядра, остается сложной задачей. Студенистое ядро входит в число тканей, которые бросают вызов обычным методам экстракции общей РНК и ее фракций из-за низкого содержания клеток и высокого содержания биополимеров, таких как протеогликаны и гликопротеины, которые нарушают чистоту и выход общей РНК и ее фракций [24]. Кроме того, упругая и плотная структура хрящевого матрикса студенистого ядра межпозвоночного диска требует жестких условий гомогенизации, которые нарушают целостность РНК. Соответственно, получение тотальной РНК из студенистого ядра с количественными показателями более 500 нг/мкл и с соотношениями A260/280 и A260/230, равными 1,5—2,0 нм, как качественными показателями является тяжело реализуемой задачей.

Отсутствие большинства воспроизводимых методов для выделения тотальной РНК и ее фракций непосредственно из тканей межпозвоночного диска затрудняет эффективное применение полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР в реальном времени) для последующего изучения нкРНК в патогенезе дегенерации межпозвоночного диска. Коллагеназа II типа уникальна среди протеаз благодаря своей способности расщеплять коллагеновые фибриллы, встречающиеся во всех типах соединительной ткани, таких как кожа, кости, сухожилия, кровеносные сосуды [25]. В этом исследовании планировалось использовать способность коллагеназы II типа расщеплять соединительную ткань для улучшения выделения тотальной РНК и ее фракций из пульпозного ядра. После анализа результатов и сравнения с обычным методом измельчения тканей в жидком азоте в этом исследовании был обобщен разумный и эффективный метод выделения тотальной РНК и ее фракций с последующим профилированием экспрессии на платформе ПЦР в реальном времени.

Материалы и методы

Сбор образцов

Образцы студенистого ядра (n = 8) были получены в периоде с сентября 2017 по декабрь 2018 года от пациентов с диагнозом «межпозвоночная грыжа пояснично-крестцового отдела» во время операции. Образцы хранились при -80 °C. Все пациенты дали письменное и устное информированное согласие на проведение исследовательской работы.

Для выделения тотальной РНК и ее фракций

TRIzol (100 мл) (Thermo Fisher Scientific, США), хлороформ, абсолютный этиловый спирт, стерильные наконечники для дозаторов, стерильные пробирки Эппендорфа 1,5 и 2 мл, охлаждаемая высокоскоростная бенчтоп-центрифуга (Thermo Fisher Scientific, США), микроцентрифуга, спектрофотометр NanoDrop-2000 (Thermo Fisher Scientific, США), центрифужная пробирка 15 мл, игла одноразовая стерильная 0,7x40 мм (22G), хлорид натрия, ацетата натрия, 100 % изопропанол, коллагеназа II типа (3 мл, 0,2 %) (Thermo Scientific, США).

Для полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)

Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roshe, Германия), стерильные наконечники для дозаторов, стерильные пробирки Эппендорфа 1,5 мл и 2 мл, пробирки для ОТ-ПЦР 0,2 мл, охлаждаемая высокоскоростная бенчтоп-центрифута, 9700 ПЦР система (Applied Biosystems, США), праймеры (Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roshe, Германия)), вода, обработанная диэтилпирокарбонатом (DEPC) (Invitrogen, США), фосфатно-буферный солевой раствор (PBS) 2 мл (Invitrogen, США).

Для ПЦР в реальном времени

FastStart Universal SYBR Green Master (Rox, Германия), стерильные наконечники для дозаторов, стерильные пробирки Эппендорфа 1,5 и 2 мл, 8 ПЦР-пробирок в стрипе 0,2 мл с крышками-колпачками, 7500 FAST ПЦР в реальном времени (Applied Biosystems, США), охлаждаемая высокоскоростная бенчтоп-центрифуга, праймеры (Invitrogen, США), вода, обработанная диэтилпирокарбонатом (DEPC) (Invitrogen), 96-луночный планшет для ПЦР в реальном времени.

Выделение тотальной РНК и ее фракций методом жидкого азота

100 мг ткани студенистого ядра (n = 4) помещали в ступку с предварительно охлажденной DEPC водой и добавляли жидкий азот для уплотнения образца. После улетучивания жидкого азота образец измельчали до порошкообразной массы с помощью пестика. В течение периода измельчения жидкий азот добавляли три или четыре раза, пока образец не был достаточно измельчен. Затем 100 мг измельченной ткани переносили непосредственно в пробирку Эппендорфа 1,5 или 2 мл, содержащую 1 мл TRIzol (Thermo Scientific, США), и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем образцы центрифугировали при 12 000 g в течение 5 мин при 4°С для осаждения непереваренной ткани. Очищенный супернатант переносили в новую пробирку и 10 раз пропускали через иглу 22G. Данный материал смешивали с 200 мкл хлороформа путем энергичного встряхивания в течение 30 с, оставляли стоять в течение 3 мин при комнатной температуре и затем центрифугировали при 12 000 g в течение 15 мин при 4°C. После центрифугирования образец разделялся на 3 фазы: верхняя, или водная (бесцветная), средняя, или интерфаза, и органическая фаза. Водный слой переносили в новую пробирку Эппендорфа 2 мл и добавляли смесь концентрированного хлорида натрия и ацетата натрия для достижения конечных концентраций 1,2 и 0,8 М соответственно. Затем тотальную РНК и ее фракции осаждали добавлением 0,3 объема 100 % изопропанола с последующей 10 мин инкубацией при комнатной температуре. Центрифугирование при 12 000 g в течение 10 мин при 4°С облегчало осаждение осадка РНК, которую дважды промывали 1 мл 75 % этанола, полученного разбавлением абсолютного этанола, и сушили в течение 5-10 мин при 37°C.

Тотальную РНК и ее фракции элюировали 20 мкл воды без РНКаз. После перемешивания (вручную) образец оставляли при 60 °C на 5 мин для ускорения растворения тотальной РНК и ее фракций в водном растворе. Дальнейшее хранение водного раствора РНК происходило при -80°C.

Выделение тотальной РНК и ее фракций методом ферментативного расщепления

100 мг ткани студенистого ядра (n = 4) разрезали на кусочки и помещали в пробирки Эппендорфа. В каждую пробирку добавляли коллагеназу II типа (3 мл, 0,2 %) (Thermo Scientific, США). Закрыв крышку, пробирки перемешивали (вручную) в течение 30 сек. Образец расщепляли при 37°С в течение 4 ч в инкубаторе с 5 % СО₂. Добавляли фосфатно-буферный солевой раствор (PBS) (2 мл) (Invitrogen, США), содержащий 10 % фетальной бычьей сыворотки, перемешивали (вручную) и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Супернатант осторожно удаляли, помещали в центрифужную пробирку на 15 мл и центрифугировали при 1200g при комнатной температуре в течение 40 с. Надосадочную жидкость осторожно удаляли в дополнительную пробирку для центрифугирования на 15 мл, в которую добавляли 5 мл PBS. После перемешивания и центрифугирования при 1200 g при комнатной температуре в течение 5 мин супернатант удалялся. TRIzol (1 мл) добавляли в центрифужную пробирку и перемешивали. Процедура проводилась на льду. Остальные этапы были идентичны стандартному способу выделения тотальной РНК и ее фракций методом использования жидкого азота, указанному выше.

Контроль качества тотальной РНК и ее фракций

С помощью спектрофотометра NanoDrop-2000 определяли количественные и качественные показатели тотальной РНК и ее фракций. Концентрация тотальной РНК и ее фракций измеряется в нг/мкл. Качественные же показатели определяются по спектру поглощения полученного раствора с тотальной РНК при трех длинах волн: 230, 260, 280 нм. Отношение поглощения при 260/280 (1,8-2,2) и отношение поглощения 260/230 (1,82-2,0) показано в таблице 2.

Синтез комплементарной ДНК (кДНК)

Метод ОТ-ПЦР включает в себя обратную транскрипцию микро-РНК с помощью специфических праймеров по stem-loop системе (stem-loop RT primers) (Invitrogen, США) и днРНК с помощью олиго (dT)18 праймера (Roche, Германия) с использованием набора Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Германия). Праймеры для ОТ-ПЦР представлены в таблице 3.

ПЦР в реальном времени

Профилирование экспрессии микро-РНК и днРНК проводилось методом ПЦР в реальном времени с помощью интеркалирующего красителя SYBR Green Master Mix (Roshe, Германия). Для ПЦР в реальном времени использовались forward и reverse праймеры (Invitrogen, США). Для нормализации данных использовали контрольные гены для микро-РНК РНК U6 и ген GAPDH для днРНК. Для каждого образца подготавливали реакционную смесь общим объемом 20 мкл для ПЦР в реальном времени, добавляя 10 мкл смеси SYBR Green Master Mix от компании Roche (Германия), 2 мкл праймеров (1 мкл reverse + 1 мкл forward), 6 мкл DEPC воды (Invitrogen, США) и 2 мкл кДНК. В итоге на одну реакцию приходится 20 мкл готового раствора. Праймеры для ПЦР в реальном времени представлены в таблице 4. Условия ПЦР в реальном времени: после первоначальной денатурации при 95°С в течение 10 мин реакции проводили в течение 40 циклов при 95°С по 10 с и 60°С по 60с.

Результаты и обсуждение

В последнее время широко изучается роль микро-РНК и днРНК в патогенезе дегенерации межпозвоночного диска. Студенистое ядро богато коллагеном II типа и аггреканом и содержит малое количество клеток. Следовательно, метод полного разрушения тканей пульпозного ядра межпозвоночного диска для достижения эффективного расщепления и повышения концентрации и выхода тотальной РНК и ее фракций, таких как микро-РНК и днРНК, очень важен.

Классический метод измельчения тканей основан на применении жидкого азота. Однако результат в данной работе в отношении к среднему значению количественного показателя тотальной РНК и ее фракций на спектрофотометре NanoDrop-2000 показал, что лизис клеток не был завершен, а именно средний показатель 344,7 ± 42,6 нг/мкл, что меньше среднего количественного показателя тотальной РНК при лизисе клеток (500 нг/мкл).

При этом водный раствор тотальной РНК и ее фракции, выделенные методом измельчения в жидком азоте, содержал много примесей и его чистота была недостаточной. Средние качественные значения были A260/280 1,63 ± 0,09 и A260/230 1,12 ± 1,1. Таким образом, метод измельчения в жидком азоте не был адекватен для извлечения тотальной РНК и ее фракций из студенистого ядра межпозвоночных дисков. Коллагеназа II типа уникальна среди протеаз благодаря своей способности расщеплять коллагеновые фибриллы, встречающиеся во всех типах соединительной ткани, таких как кожа, кости, сухожилия, кровеносные сосуды. Поэтому использование коллагеназы II типа для расщепления структур студенистого ядра межпозвоночного диска для получения высококачественной РНК имеет место быть. В данном случае результаты среднего качественного и количественного значения были равны 656,7 ± 61,5 со средним отношением A260/280 1,93 ± 0,02 и средним отношением A260/30 1,44 ± 0,04. Хотя и показатель A260/230 был далек от идеала, его значения были лучше, чем в случае использования жидкого азота.

Другие результаты были связаны с профилированием экспрессии микро-РНК и днРНК с помощью ПЦР в реальном времени. При определении эффективности проведения работы на ПЦР в реальном времени можно использовать методику относительных количественных измерений путем определения пороговых циклов (Ct). Иными словами, проверкой изменения экспрессии микро-РНК и днРНК является показатель Ct (табл. 5). Уровни Ct обратно пропорциональны количеству нуклеиновой кислоты-мишени и эталонного гена для нормализации данных в образце, т. е. чем ниже уровень Ct, тем больше количество нуклеиновой кислоты-мишени и эталонного гена для нормализации данных в образце.

Заключение

Метод ферментативного расщепления для извлечения тотальной РНК и ее фракций из студенистого ядра межпозвоночного диска достиг идеальной целостности и практически высокой чистоты. Более того, не было никакого загрязнения белка, полисахаридов или коллагена. Поэтому метод расщепления ферментом коллагеназы II типа подходит для анализа, а положительные результаты профилирования экспрессии микро-РНК и днРНК являются доказательством для проведения новых исследований в изучении микро-РНК и днРНК в патогенезе дегенерации межпозвоночного диска и заслуживают популяризации. Помимо микро-РНК и днРНК существуют другие классы нкРНК, такие как малая ядерная РНК, малая ядрышковая РНК и малая интерферирующая РНК. Способ может быть адаптирован для других типов нкРНК, связанных с исследованиями роли нкРНК в патогенезе дегенеративных процессов в межпозвоночном диске.

Информация о конфликте интересов. Конфликт интересов отсутствует.
Информация о спонсорстве. Данная работа была выполнена при финансовой поддержке гранта Республики Башкортостан молодым ученым от 7 февраля 2020 № УГ-43.