Экстракция малых РНК из биологических жидкостей человека для последующего секвенирования нового поколения

Введение

Исследователи, которые хотят выполнить секвениро- вание нового поколения (NGS), должны решить ряд проблем, связанных со способами и методами подго­товки образцов. Способы экстракции РНК из тканей или клеток, создание базы данных для секвенирования и типов секвенирования, которые будут выполняться, становятся решающими факторами в дизайне экспери­ментальной работы [1]. В частности, для секвенирова­ния различных классов молекул РНК, по крайней мере частично, определяются и упорядочиваются по их раз­меру. Микро-РНК (miRNAs, 18-22 нуклеотида), малые интерферирующие РНК (siRNAs, 20-25 нуклеотидов) и PIWI-взаимодействующие РНК (piRNA, приблизи­тельно 30 нуклеотидов) являются разновидностями малых некодирующих РНК, участвующих в последова­тельном ингибировании экспрессии генов на посттран- скрипционном уровне [2]. Хотя в настоящее время ма­лые РНК известны как наименьший функциональный класс, но их биологическая значимость для регулирова­ния экспрессии генов все еще изучается на протяжении 20 лет с момента их открытия [3]. С недавних пор NGS используется для получения небольших дифференци­альных профилей экспрессии РНК для изучения этапов развития тканей, типов тканей и патологических со­стояний, таких как онкология, сердечно-сосудистые за­болевания и психические расстройства с потенциалом для поиска новых биомаркеров [4-7].

До недавнего времени считалось, что способы экстрак­ции РНК из тканей позволяли извлекать все виды РНК: примерно от длинных до малых РНК, которые включают кодирующие РНК (мРНК), длинные некодирующие РНК (lncRNA), транспортные РНК (тРНК), малые ядрышковые РНК (snoRNA), PIWI -взаимодействующие РНК (piRNA) и микро-РНК (miRNA) [2]. Экстракция всех видов РНК подразумевается в описании многих коммерчески до­ступных наборов и методов, описывающих изоляцию тотальной РНК. Фактически они используются для мето­дов, которые вообще не извлекают малые РНК, но имеют­ся такие наборы, которые основываются на использова­нии мини-колонок с диоксидом кремния (SiO₂), которые и проводят экстракцию малых РНК. Кроме того, в ряде наборов использовались соотношения солей и спирта, не достаточные для изоляции малых РНК из образцов. В настоящее время существует множество коммерчески доступных наборов для экстракции малых РНК. Хотя ме­тодики имеют некоторые отличия, большинство из них используют тиоцианат гуанидиния для денатурирования РНКаз и белков с последующей экстракцией РНК с фе­нол-хлороформом [8, 9]. Систематическое тестирование показало, что производительность наборов для изоляции РНК варьируется в зависимости от типов образцов [10]. Ряд наборов лучше подходят к конкретным видам об­разцов, чем к другим. Например, соединительная ткань, такая как мышечная, должна обрабатываться иначе, чем богатая липидами нервная ткань. Лучшим вариантом мо­жет быть выбор комплекта, специально разработанного для решения проблем с экстракцией РНК для конкретно­го типа ткани.

Из трех лучших наборов для изоляции тотальной РНК и ее фракций набор MaxRecovery BiooPure RNA (Bio Scientific, Austin, TX, USA) не был выбран, так как про­являлась некоторая потеря РНК в отдельных образцах. Стандартный набор MirVana Kit (Life Technologies), ко­торый в своей методике не предлагает исследователям возможность выделения белка из исходного лизата, хо­рошо работает, но не был выбран, потому что первый буфер добавляется в соотношении 10:1 к объему образ­ца. Таким образом, для каждого образца объемом 1 мл потребуется более 50 отдельных этапов центрифугиро­вания, что делает этот метод логически необоснован­ным для выделения РНК из биологических жидкостей. Набор MirVana PARIS (выделения белка и РНК) Kit (Life Technologies) наилучшим образом обеспечивал выход РНК вследствие легкости применения при системати­ческом сравнении с другими коммерчески доступными наборами и методами [10].

Набор MirVana PARIS включает использование запатен­тованного лизирующего буфера с β-меркаптоэтанолом, который служит для денатурирования белков био­логических жидкостей, экстракции РНК фенол-хло­роформом из образца, с высоким содержанием белка, липидов и ДНК, с последующей очисткой на спирто­вой/колоночной основе перед элюированием РНК. В этой работе мы описываем метод экстракции малых РНК длиной менее 200 нуклеотидов из биологических жидкостей человека и его оптимизацию по экстракции малых РНК длиной менее 200 нуклеотидов из биологи­ческих жидкостей человека [10]. Основные изменения в дополнение к стандартному протоколу, предоставлен­ному изготовителем, включают повторное извлечение РНК вместо удаления остаточного фенол-хлороформа путем добавления воды, свободной от РНКаз, ремик- сации и отделения другого объема раствора. Хотя уро­вень для лучшей экстракции малых РНК с использова­нием модификаций, предложенных в этой работе, будет варьироваться в зависимости от конкретного набора, к которому применяется эта методика, было показано, что он обладает кроссплатформенной применимостью [10]. Наборы, использующие кислота-фенол-хлоро- формную основу, могут быть полезны с некоторыми дополнениями для набора mirVana PARIS. Выход РНК из всех образцов, которые были протестированы, полу­чался из второй водной экстракции из остаточного кис- лота-фенол-хлороформного материала [10]. Поскольку современные методы NGS для малых РНК выполня­ются отдельно от РНК с более длинной цепочкой ну­клеотидов, тот факт, что лучшие наборы для изоляции малых или больших молекул РНК различны, не пред­ставляет проблем на момент этой работы.

Материалы

1. MirVana PARIS Kit отAmbion (см. примечание1):

• раствор для промывки 1;
• раствор для промывки 2/3 (см. примечание 2);
• сборные пробирки и фильтровальные картриджи (см. примечание 3);
• буфер для лизиса клеток (см. примечание 4);
• 2 денатурирующий раствор, тиоцианат гуанидиния- фенол-хлороформная основа (см. примечание 5);
• раствор для элюирования (см. примечание 6).

2. Абсолютный этиловый спирт (95,6-100 %) ACS- класса или лучше (см. примечание 7).
3. β-меркаптоэтанол.
4. 7 M ацетат аммония.
5. Криопробирки 2 мл (для образцов).
6. Бенчтоп-центрифуга (скорость не менее 800 об/мин).
7. Бокс биологической безопасности, класс II.
8. Вытяжной шкаф с отрицательным воздушным пото­ком (см. примечание 8).
9. Центрифуга, способная поддерживать комнатную температуру и центрифугировать по меньшей мере 10 000 об/мин, используя ротор, способный удерживать конические пробирки 15 мл (см. примечание 9).
10. Лабораторный нагревательный блок, установлен­ный на 95-100 °C.
11. Орбитально-качающийся шейкер (см. примеча­ние 10).
12. Пробирки 1,5 мл, не содержащие РНКаз (см. при­мечание 11).
13. Салфетки или растворы в виде спрея для обеззара­живания РНКаз (см. примечание 12).

Методы

Приготовление образцов

После взятия биологической жидкости (цереброспи­нальная жидкость) помещаем образцы в криопробирки 2 мл, их необходимо быстро заморозить в жидком азоте либо в суспензии абсолютного этанола с сухим льдом, чтобы сохранить профиль РНК (см. примечание 13). Использование шкафа биобезопасности требуется при обращении с биологическими образцами для защи­ты исследователей от воздействия патогенов человека.

Подготовка набора MirVana PARIS Kit

1. Инкубируем компоненты mirVanaPARISKit при ком­натной температуре (см. примечание 14).
2. Добавляем 21 мл 100 % этанола в раствор для про­мывки РНК (см. примечание 7).
3. Добавляем 40 мл 100 % этанола в раствор для про­мывки 2/3 (см. примечание 7 и 15).
4. Добавляем 375 мкл β-меркаптоэтанол в 2 денатури­рующий раствор см. примечание 16).
5. Добавляем аликвоту 1 мл воды, свободной от РНКаз (см. примечание 6), в микроцентрифужные пробирки 1,5 мл и помещаем их на нагревательный блок, установ­ленный на 95 °C. Эта предварительно нагретая вода бу­дет использоваться для элюирования РНК из мембран мини-колонок на конечной стадии (см. примечание 17).

Измененная методика протокола MirVana PARIS Kit

1. Добавляем равный объем 2 денатурирующего рас­твора к замороженному образцу (цереброспинальная жидкость) (см. примечание 18).
2. Помещаем образец на орбитально-качающийся шей- кер при комнатной температуре до полного оттаивания и смешивания (см. примечание 10).
3. Инкубируем в течение 10 мин при комнатной тем­пературе.
4. Добавляем равные объемы тиоцианат гуанидиния, фенола и хлороформа (кислотно-фенол-хлороформная основа) (см. примечание 19).
5. Смешиваем на вортексе в течение 30 сек.
6. Центрифугируем при 10,000 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре (см. примечание 20).
7. Осторожно снимаем пробирки с центрифуги, и нуж­но убедиться, что имеются верхний (водный) слой и нижний (органический) слой.
8. Переносим приблизительно 90 % верхней водной фазы от этой первой экстракции в чистую пробирку 2 мл и определяем объем. Позаботьтесь о том, чтобы мениск оставшегося объема водной фазы не касался интерфазы (см. примечание 21). Откладываем в сторону.
9. В оставшийся органический остаток добавляем объем воды, свободной от РНК, эквивалентный водному объ­ему, который был просто перенесен в новую пробирку.
10. Смешиваем на вортексе в течение 30 сек.
11. Центрифугируем при 10,000 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре.
12. Переносим приблизительно 90 % верхней водной фазы этой второй экстракции в ту же самую пробир­ку, которая содержит водный объем от первой водной фазы (белки и РНК) (см. примечание 21). Остальная часть с органической фазой теперь может быть выбро­шена (см. примечание 5).
13. Добавляем 1,5 объема 100 % этанола в общий объ­ем полученной жидкости, рассчитанный от удаленного из первого и второго органических экстрактов (см. при­мечание 7).
14. Инвертируем 10 раз для смешивания и даем раство­ру инкубироваться при комнатной температуре в тече­ние 10 мин.
15. Добавляем 700 мкл полученной жидкости в мини­колонки и центрифугируем при 800 об/мин при ком­натной температуре (см. примечание 22), сбрасываем полученную жидкость из сборной пробирки и повто­ряем шаги, пока не закончится исследуемый образец (см. примечание 3).
16. Добавляем 700 мкл подготовленного промывоч­ного раствора 1 в мини-колонки и центрифугируем при 800 об/мин в течение 30 сек. для пропускания рас­твора через мембрану мини-колонок (см. примеча­ния 23 и 22). Сбрасываем полученную жидкость из сбор­ной пробирки (см. примечание 3).
17. Добавляем 500 мкл подготовленного промывочно­го раствора 2/3 в мини-колонки (см. примечание 24) и центрифугируем при 800 об/мин в течение 30 сек. (см. примечание 22). Сбрасываем полученную жид­кость из сборной пробирки.
18. Повторяем шаг
19. Без применения каких-либо других растворов ми­ни-колонки после центрифугирования и их пустые сборные пробирки в течение 30 сек. высушиваются от остаточного этанола.
20. Перемешиваем мини-колонки в новые сборные пробирки (см. примечание 25).
21. Добавляем 100 мкл 95 °С (см. примечание 26) воды, сво­бодной от РНКаз, (см. примечание 6) в мини-колонки и ин­кубируем при комнатной температуре в течение 1 минуты.
22. Центрифугируем при 10,000 об/мин в течение 1 мин для элюирования РНК через мембрану мини-колонок (см. примечание 27).
23. Повторяем шаги 21 и 22.
24. Фильтрующий компонент мини-колонок можно выбросить, поскольку РНК элюируется из фильтра и находится в сборной пробирке.
25. Центрифугируем данные образцы с РНК на макси­мальной скорости в течение 1 мин до выпадения осадка.
26. Избегая осадка, переносим РНК из данной пробирки в новую пробирку. Приступаем к осаждению этанолом для подготовки малых РНК к NGS (см. примечание 27).
27. Добавляем 0,5 объема 7 М ацетата аммония до ко­нечной концентрации 2-2,5 М и хорошо смешиваем (см. примечание 28).
28. Добавляем 4 объема от объема РНК абсолютного спирта и хорошо смешиваем. Инкубируем полученный образец при температуре -20 °С с 4 до 12 часов.
29. Центрифугируем при 16,000 об/мин в течение 30 мин. при 4 °C для осаждения РНК.
30. Промываем полученные гранулы дважды 80 % спиртом.
31. Ресуспендируем гранулы РНК в объеме воды, сво­бодной от РНКаз, следуя стандартному протоколу про­изводителя.

Примечания

1. Комплект MirVana PARIS рассчитан на 40 реакций при использовании протокола, предоставленного про­изводителем, и предлагаемых тканей (см. Руководство пользователя Ambion mirVana PARIS Kit). С модифици­рованным протоколом, описанным здесь, этот комплект представлен приблизительно для 20 мл биожидкости.
2. 2/3 промывочного раствора используется для вто­рой и третьей промывки колонки на основе диоксида кремния, содержащей иммобилизованную РНК.
3. Фильтр мини-колонки и ее сборная пробирка будут повторно использоваться на всех этапах в этом моди­фицированном протоколе, за исключением последнего, в котором завершена изоляция и очистка РНК.
4. Буфер для лизиса клеток включен в список реаген­тов, однако он не будет использоваться для текущего метода, который был разработан для образцов биоло­гических жидкостей.
5. Кислота-фенол-хлороформная основа является ед­кой, поэтому при обращении и утилизации необходимо соблюдать осторожность. Необходимы средства инди­видуальной защиты и использование вытяжного шкафа.
6. В текущем протоколе для элюирования тоталь­ной РНК и ее фракций используют воду, свободную от РНКаз.
7. Поскольку соотношение этанола и водного буфера важно независимо от того, растворена ли РНК, или вы­пала в осадок в растворе, крайне важно использовать абсолютный этанол ACS-класса (ACS — Американское химическое общество) или лучше при приготовлении спиртовых буферных растворов. Каждый раз, когда обезвоженный этанол подвергается воздействию окру­жающей среды, в нем растворяется вода из окружаю­щей среды, что впоследствии уменьшает содержание этанола в растворе ниже по потоку.
8. Из-за соображений безопасности, за исключением по­следнего шага, весь протокол должен выполняться в вы­тяжном шкафу с отрицательным воздушным потоком, предназначенным для летучих химических веществ.
9. Важным аспектом молекулярной функции всех буферов и растворов является их pH. Поскольку тем­пература оказывает существенное влияние на рН, ее следует контролировать. Все описанные здесь шаги выполняются при комнатной температуре, если не указано иное. Однако центрифугирование может увеличить температуру центрифугируемого образца. Таким образом, центрифуги, используемые на этапах центрифугирования без мини-колонок, должны быть установлены на стандартную температуру окружаю­щей среды 25 °С. Для кратковременных этапов центри­фугирования, например для пропускания жидкости через мини-колонки, центрифуга с контролируемой температурой не требуется.
10. Не важно, при какой скорости используется стан­дартный лабораторный орбитально-качающийся шей- кер, если он позволяет тщательно перемешивать замо­роженные образцы в денатурирующем растворе.
11. Мы обнаружили, что сборные пробирки, поставля­емые с комплектом mirVana PARIS Kit, не всегда плот­но закрывались. Кроме того, использование пробирок с неплотно закрывающимися крышками приводит к ис­парению и уменьшает остаточный материал РНК, находя­щийся в сборной пробирке. Поэтому, как только РНК элю­ируется из мини-колонки, ее следует перенести в плотно закрывающуюся стерильную пробирку без РНКаз.
12. Очистим рабочий стол и все оборудование, которое будет использоваться для экстракции РНК, с помощью растворов-дезактиваторов РНКаз или салфеток в со­ответствии с рекомендациями производителя для этих продуктов. Следует принять общие меры предосторож­ности, чтобы свести к минимуму возможное воздей­ствие РНКаз на РНК.
13. Хотя малые РНК относительно стабильны в биоло­гических жидкостях [12], обрабатывая образцы одина­ковым способом, каждый раз можно будет гарантиро­вать минимизацию смещения сбора и сохранить общий профиль тотальной РНК. В замороженных образцах РНКазы неактивны из-за низкой температуры, которая не позволяет воде находиться в жидкой форме, необхо­димой для того, чтобы эти ферменты меняли структуру РНК. Образцы оттаивают в присутствии 2 денатури­рующего раствора, чтобы гарантировать, что РНКазы будут денатурированы, поэтому они необратимо инак­тивируются [11].
14. Набор MirVana PARIS поставляется при комнатной температуре, а компоненты хранятся либо при комнат­ной температуре, либо при температуре 4 °C в соответ­ствии с правилами производителя. Для использования в обычном режиме или в текущем модифицирован­ном протоколе перед использованием компонентов MirVana Paris Kit необходимо довести их до комнатной температуры.
15. В промывочном растворе 2/3 может образовывать­ся осадок белого цвета, но это не имеет никакого значе­ния, и его следует оставить в бутылке при использова­нии этого раствора.
16. 2 денатурирующий раствор образует осадок при ре­комендуемой температуре хранения 4 °C. После про­грева до комнатной температуры нужно осмотреть, остался ли осадок в растворе. Если присутствует твер­дый белый осадок, нужно плотно закрыть бутылку и при 37 °C перемешивать его до полного растворения.
17. Для обеспечения герметичности пробирок и ис­ключения испарения раствора под воздействием повы­шенной температуры и давления при центрифугирова­нии можно использовать алюминиевую фольгу.
18. Оцениваем объем биологического образца. Если пробирка для образцов заполнена больше, чем напо­ловину, нужно предотвратить добавление равного объ­ема 2 денатурирующего раствора и добавить только 1/10 объема 2 денатурирующего раствора, энергично перемешивая до тех пор, пока замороженный образец не будет слегка разморожен. Перенесите этот образец и остаточный раствор в большую пробирку, где есть оставшийся 2 денатурирующий раствор.
19. Небольшой объем водного буфера покрывает орга­ническую кислотно-фенол-хлороформную основу. При использовании этого реагента убедитесь, что присут­ствуют два разных слоя. Следует избегать взбалтыва­ния этого раствора, чтобы слои не смешивались. Если раствор выглядит мутным или присутствуют пузырьки воздуха, следует подождать осаждения до тех пор, пока два слоя не будут заметно разделены. При использова­нии этого раствора обязательно удалите кислотно-фе- нол-хлороформную основу из-под водного буферного слоя. Когда объем раствора уменьшится, обязательно проконтролируйте, что вы удалили эту основу, а не вы­шележащий водный буфер.
20. Стадия фазового разделения фенол-хлороформа включает центрифугирование относительно большого объема. Поэтому рекомендуется, чтобы ротор для цен­трифуги был с регулируемой температурой (см. приме­чание 9) и был совместим с центрифужными пробир­ками. Пробирки должны быть способны удерживать раствор в 5 раз больше своего объема.
21. В зависимости от образцов (биологических жидко­стей) белая интерфаза может и не наблюдаться, особен­но для второй экстракции. При тщательном осмотре фазы должны быть видны и не должны смешиваться при пипетировании верхнего водного объема.
22. Мини-колонки из набора MirVana PARIS были раз­работаны для протокола изготовителя. С помощью модифицированного метода большие объемы, чем пер­воначально предполагалось, проходят через весь стол­бец мини-колонок. Поскольку РНК будет связываться с мембраной (диоксид кремния) столбца мини-коло­нок, лучше всего тщательно поддерживать целостность столбца. Поэтому максимальная скорость центрифуги­рования, рекомендуемая для пропускания водного рас­твора экстракции/этанола, составляет 800 g.
23. Готовый промывочный раствор 1содержит 21 мл 100 % этанола.
24. Готовый промывочный раствор 2/3 содержит 40 мл 100 % этанола.
25. Чтобы предотвратить проникновение высушенно­го остаточного материала в свежий резервуар пробир­ки, очистите внешнюю поверхность колонки фильтра, используя протирание раствором 70 % этанола, но из­бегайте смачивания фильтра.
26. Разогреваем воду, свободную от РНКаз, на тепло­вом блоке до 95 °C и используем эту воду для элюиро­вания РНК из мембраны мини-колонок. Чтобы учесть, что при этой температуре происходит испарение, нуж­но удвоить объем воды, которая будет использоваться, а также она должна быть предварительно нагрета.
27. Если РНК будет использоваться для любых других методов секвенирования, помимо малых РНК, может потребоваться обработка ДНК-образца.
28. Осаждение РНК этанолом должно всегда происхо­дить с добавлением солевых растворов, и они должны быть тщательно перемешаны перед добавлением спирта.

Обсуждение

Мы протестировали различные коммерчески доступные наборы для извлечения РНК и обнаружили, что некото­рые из них были более эффективными при выделении малых РНК из биологических жидкостей, чем другие. Также были проверены модификации протоколов, сде­ланных другими исследователями, для более высокого выхода РНК [13]. Лучшие условия для получения высо­кого выхода малых РНК из биожидкостей описаны в этой методике, так как мы считаем, что она имеет ценность для исследователей, которые планируют работать с NGS. Настоящее исследование специально было разработано и протестировано для изоляции малых РНК из церебро­спинальной жидкости человека для последующей рабо­ты с NGN на платформе Illumina (Illumina, San Fransico, CA, USA). Также метод может быть дополнительно при­менен к образцам слюны и мочи человека [14]. Описанный здесь метод был протестирован и показал, что он улучшает восстановление или выделение малых РНК из цереброспинальной жидкости. Однако этот ме­тод не ограничивается этим типом образцов и может разумно применяться к другим типам биологических жидкостей [15]. Поскольку каждый тип выборки может создавать определенные проблемы, мы настоятельно рекомендуем тестировать различные методы для каж­дого конкретного типа образца, т. е. типа ткани. Доказана роль секвенирования следующего поколения в дифференциальной диагностике сложных новообра­зований. Acosta и др. оценили потенциальное примене­ние NGS в диагностике этих редких новообразований [16]. В исследование были включены четыре новооб­разования. Два были диагностированы как смешанная аденонейроэндокринная карцинома желчного пузыря и метастатический папиллярный рак щитовидной желе­зы с плоскоклеточной дедифференцировкой, а два были интерпретированы как аденокарцинома пищевода в аде­нокарциному легких и мелкоклеточная карцинома лег­кого на/в менингеальную меланому. Это исследование иллюстрирует роль NGS в дифференциальной диагно­стике редких новообразований как дополнения к свето­вой микроскопии и иммуногистохимии.

Заключение

В этой статье мы описали методику для экстракции ма­лых РНК из биологических жидкостей человека для по­следующего секвенирования нового поколения, кото­рую сочли полезной при исследованиях данных типов РНК в качестве потенциальных биомаркеров. Как ука­зано выше, подготовка образцов, выбор реагентов — немаловажные факторы, учитывая текущую нехватку знаний об их влиянии на последующее секвенирование нового поколения малых РНК. Кроме того, тщательно построенный план эксперимента, связанный с выбо­ром типов образцов и техники экстракции малых РНК, важен для получения хороших результатов в работе с секвенированием нового поколения.