Особенности метастазирования рака яичника

Введение

Рак яичника (РЯ) является одним из наиболее рас­пространенных онкологических заболеваний женской репродуктивной системы (второе место после рака мо­лочной железы для женщин старше 40 лет) [1]. Данная патология характеризуется высокой смертностью в те­чение первого года после установления диагноза (22 %) и самой высокой летальностью среди всех гинекологи­ческих злокачественных опухолей. Пятилетняя выжи­ваемость при РЯ составляет менее 30 % [2]. Ежегодно в мире регистрируется 240 000 новых случаев РЯ [1]. Для болезни специфично длительное бессимптомное течение, в связи с чем диагноз устанавливают в основ­ном на III-IV стадиях [3], после обширного распростра­нения опухоли в брюшной полости, что ограничивает эффективность хирургического вмешательства и хими­отерапии. Основной причиной смерти от РЯ являются резистентные к терапии метастазы [2].

Более 90 % случаев РЯ характеризуются эпителиальной гистологией, включая подтипы серозный, муцинозный, эндометриоидный, светлоклеточный, переходный, пло­скоклеточный, смешанный, недифференцированный и неклассифицируемый. Среди них серозный эпите­лиальный РЯ является самым распространенным [4]. Существуют 3 потенциальные области возникновения РЯ: поверхность яичника, фаллопиевы трубы и выстлан­ные мезотелием перитонеальные полости. Туморогенез РЯ развивается по ступенчатому механизму от медлен­но растущей пограничной опухоли до хорошо диффе­ренцированной карциномы (тип I), или формируется генетически нестабильная быстро метастазирующая высокозлокачественная серозная карцинома (тип II). В отличие от гематогенно метастазирующих опухолей, раковые клетки при РЯ диссеменируются главным об­разом внутри брюшной полости и только поверхностно инвазивны. Однако быстрорастущие метастазы сдавли­вают внутренние органы и часто устойчивы к химиоте­рапии, что является причиной высокой смертности [3]. Большой сальник (БС) является самой частой областью метастазирования РЯ [5]. Диссеминация из первичной опухоли происходит главным образом путем слущивания с поверхности капсулы яичника клеток, которые затем распространяются током циркулирующей пери­тонеальной жидкости. И, хотя раковые клетки могут прикрепляться к любой внутрибрюшной поверхности, БС является избирательным местом для их фиксации и агрессивного опухолевого роста с последующим рас­сеиванием по всем частям брюшной полости [6].

БС является областью для метастазирования не только РЯ, но и опухолей других органов брюшной полости. У разных видов животных БС обычно выходит за пре­делы желудка и состоит из мембранных слоев жировой ткани с агрегатами лейкоцитов, вкрапленных среди адипоцитов. Первичное прикрепление и последующий рост раковых клеток ограничены определенными участ­ками внутри БС — млечными пятнами (МП), состоя­щими из организованных агрегатов иммунных клеток, которые содержат сложную сеть капилляров с высокой плотностью сосудов, способствующих выживанию РК [7]. Сходные с МП структуры, известные как FALC (fatassociated lymphoid clusters), обнаружены и в других жировых депозитах: перикардиальном, средостенном и в плевральной полости. Они подобны МП по стро­ению, содержат те же популяции лейкоцитов и выпол­няют аналогичные функции. Однако МП отличаются наибольшим количеством кластеров клеток на 1 грамм ткани по сравнению с FALC. Вокруг гонад и в подкож­ном жире очень мало скоплений лейкоцитов, которые бы напоминали МП или FALC [8]. Доказано, что млеч­ные пятна являются основным местом имплантации злокачественных клеток при перитонеальной диссеминации [9]. В эксперименте in vivo было выявлено, что клетки РЯ размещаются и растут преимущественно в МП сальника, а не в отложениях жира в брюшине. Подобным же образом среда, кондиционированная жи­ровой тканью, содержащей МП, вызывает миграцию на 75 % больше РК по сравнению со средой, лишенной МП [10].

Наличие скрытых метастазов в БС на ранней стадии РЯ стало причиной включения оментэктомии в хи­рургическое лечение РЯ с целью точного определения стадии и предотвращения прогрессирования болезни. В то же время результаты лабораторных исследований о роли БС и его МП в развитии РЯ противоречивы [11]. С одной стороны, БС способствует прогрессированию опухолевого процесса. С другой стороны, имеются дан­ные о противоопухолевых свойствах БС [9], которые могли бы стать основой таргетной терапии. Кроме того, на ранней стадии РЯ изолированные микрометастазы в БС встречаются редко (в 2-7 % случаев) и чувстви­тельны к химиотерапии [12]. Сомнительной является также необходимость удаления БС при запущенных случаях РЯ. Так, анализ результатов хирургического лечения 20 975 пациентов с инвазивным РЯ показал, что оментэктомия не улучшает выживаемость при IIIA стадии, в связи с чем встает вопрос о целесообразности этой процедуры [13]. Более актуальным и перспектив­ным является подход в изучении морфофункциональ­ных особенностей БС как для прогнозирования исхода РЯ, так и для разработки наиболее эффективных спосо­бов таргетной терапии.

Роль молекул экстрацеллюлярного матрикса и клеток большого сальника в метастазировании рака яичника

БС взрослого человека имеет общую площадь поверхно­сти около 1500 см² и состоит из клеток мезотелиального происхождения. Он свисает в виде фартука над орга­нами брюшной полости, контактируя с селезенкой, же­лудком, поджелудочной железой и толстой кишкой. БС участвует в васкуляризации, ускоренном заживлении и ограничении инфекции в брюшной полости за счет проявления ангиогенной, фибротической, иммунной активностей и содержания стволовых клеток. Однако данные свойства могут способствовать развитию па­тологических процессов, таких как метастазирование [14]. Млечные пятна БС, являющиеся основным ме­стом для имплантации клеток РЯ при перитонеальной диссеминации, представляют собой небольшие струк­туры без капсулы, которые начинают формироваться у эмбриона человека с 20-й по 35-ю неделю беременно­сти. Они состоят из макрофагов, лимфоцитов и плазма­тических клеток, которые доставляются кровеносными и лимфатическими сосудами из кроветворных органов. Механизм образования МП связан с агрегацией боль­шого количества иммуноцитов в периваскулярные об­ласти клубочковой сети кровеносных сосудов для об­мена жидкости между брюшной полостью, кровотоком и окружающей тканью БС. Сальниковые клубочки ле­жат непосредственно под прерывистым слоем мезотелия, который содержит поры и устья, обеспечивающие прямое сообщение с брюшной полостью [9]. При метастазировании клетки РЯ взаимодействуют с микро­окружением МП, к которым относятся мезотелиоциты, фибробласты, адипоциты, эндотелиоциты, стромаль­ные компоненты [4]. МП в большом сальнике значи­тельно отличаются по строению, клеточному составу и функционированию от обычных лимфоидных орга­нов. Кластеры лейкоцитов в МП поддерживаются рети­кулярной сетью стромальных фибробластов и не содер­жат фолликулярные дендритные клетки. Т-лимфоциты группируются вокруг кровеносных сосудов и в обла­сти расположения В-клеток. Выявляются CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетки, однако, в отличие от лимфоидных органов, нет четкой зоны их расположения. Значительную часть клеток МП составляют В-лимфоциты. Однако количе­ство IgM^hiIgD^lo В1-клеток превышает таковое IgM^loIgD^hi В2-клеток, тогда как в обычных лимфоидных органах наблюдается обратная картина [8]. В норме клеточ­ный состав МП следующий: макрофаги — 46,9 %, Т-лимфоциты — 21,1 %, В-лимфоциты — 18,7 %, другие иммунные клетки — 13,3 %. Размеры МП при метаста­зах в них значительно возрастают. Например, при раке толстой кишки их диаметр увеличивается в среднем до 768 мкм (в норме 293 мкм), а клеточный состав меня­ется в пользу Т-клеток (44,7 %) и В-лимфоцитов (26,8 %) с относительным уменьшением количества макрофагов (18,3 %) и других иммунных клеток (10,2 %) [15].

БС поддерживает уникальную популяцию CD4⁺ ре­гуляторных клеток, которые экспрессируют хемокиновые рецепторы CCR1 и CCR2 и на высоком уровне синтезируют IL-10 и CD36 (участвует в метаболизме жирных кислот) [16]. Кроме того, для РЯ, в отличие от доброкачественных опухолей яичника, характерен высокий уровень CD4+ CD25^high CD127^low Т-супрессоров и ассоциированных с ними цитокинов TGF-β1 и IL-19R. Уровни этих маркеров коррелируют с метастазами РЯ. Важное значение в регуляции пролиферации, апоптоза и ангиогенеза клеток РЯ играют матриксные металло­протеиназы (ММР), среди которых ММР-2 и ММР-9 денатурируют и расщепляют главным образом кол­лаген IV типа и желатин. Тканевые ингибиторы матриксных металлопротеиназ (TIMP) играют ключевую роль в поддержании гомеостаза экстрацеллюлярного матрикса и его ремоделировании при повреждении. Изменения экспрессии MMP-2 и TIMP-2 при РЯ тесно связаны с уровнями IL-10 и TGF-β1, секретируемыми CD4⁺ Т-супрессорами [17]. Макрофаги БС способ­ствуют миграции и колонизации клеток РЯ в нем пу­тем продукции хемокиновых лигандов (CCL6 у мыши и CCL23 у человека), взаимодействующих с хемокиновыми рецепторами 1 (CCR1 — chemokine recep­tor 1), за счет чего активируются пути PI3K и ERK1/2. Истощение макрофагов уменьшает колонизацию БС раковыми клетками [18]. В экспериментах на мышах было показано, что за метастатическое распростране­ние клеток РЯ отвечают в основном CD163⁺ Tim4⁺ ре­зидентные сальниковые макрофаги [19]. В моделях ор­тотопического РЯ выявлено, что приток нейтрофилов в БС является необходимым предварительным этапом метастазирования. Ткань РЯ продуцирует воспалитель­ные факторы (IL-8, MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), GRO-α и GRO-β (growth-regulated oncogene)), стимулирующие нейтрофилы к мобилизации и экструдированию хроматиновых сетей, называемых внекле­точными ловушками нейтрофилов (NET — neutrophil extracellular traps). Строма БС также может содержать факторы, такие как IL-8 и MCP-1, стимулирующие NET. Еще до метастазов у мышей с РЯ и у женщин с ранни­ми стадиями РЯ выявляются NET в большом сальни­ке. В эксперименте было показано, что формирование метастазов в БС снижается у мышей с дефицитом вы­работки нейтрофилами пептидиларгинин деиминазы 4 (PAD4), необходимой для формирования NET [20].

Для роста раковых клеток необходимы специфические метаболические изменения в БС. Сравнительный протеомный анализ меток РЯ с высоким и низким метаста­тическим потенциалом показал, что метастазирование сопровождается активацией участвующих в метабо­лизме жирных кислот генов, которые усиливают синтез фосфолипидов с относительно короткими цепями жир­ных кислот (миристиновая кислота). Одним из ключе­вых факторов, способных преобразовывать липидный профиль раковых клеток для метастазирования, явля­ется белок ACSL1 (long-chain-fatty-acid-CoA ligase 1), стимулирующий АМФ-активируемую протеинкиназу и Src-путь посредством миристоилирования, что при­водит к усилению окисления бета-жирных кислот [21]. Важнейшими источниками последних являются пер­вичные адипоциты БС, которые способствуют хоумингу, миграции и инвазии клеток РЯ. Данные процессы ак­тивируются адипокинами, такими как IL-8. Адипоциты действуют как источники энергии для раковых клеток. По сравнению с первичным РЯ для метастазов в БС специфичны более высокие уровни белка FABP4 (fatty acid-binding protein 4) [22]. Для клеток РЯ характер­ны высокие уровни CD36-рецепторов жирных кислот на плазматической мембране, которые способствуют экзогенному поглощению молекул, предоставляемых адипоцитами БС. Ингибирование CD36 предотвращает развитие индуцированного жировыми клетками злока­чественного фенотипа [23].

В метастазах РЯ в большом сальнике белок р53 со­вместно с вырабатываемым адипоцитами IL-8 активи­рует экспрессию FABP4, способствуя адсорбции жир­ных кислот из адипоцитов для поддержания быстрого роста раковых клеток [24]. Для серозного РЯ высокой степени злокачественности характерны мутации гена ТР53, которые обнаруживаются в 96 % случаев данного типа опухоли. Мутации вызывают потерю нормальной функции белка р53 [25], который является не только онкосупрессором, но участвует также в регуляции кле­точного метаболизма, влияя таким образом на метастазирование РЯ. Мутантный белок р53 может взаимо­действовать со стеринсвязывающими белками (SREBP) и гуанидиноацетат-N-метилтрансферазой (GAMT). Это приводит к усилению экспрессии генов ключевых фер­ментов, участвующих в биосинтезе жирных кислот и хо­лестерина и в ингибировании окисления жирных кислот. Таким путем мутации гена ТР53 способствуют анаболиз­му липидов и ускоряют рост и прогрессирование опухо­ли. Кроме того, повышенное количество тромбоцитов в микроокружении РЯ приводит к усилению синтеза TGF-β, который действует согласованно с мутантным р53 в отношении стимуляции метастазирования за счет усиления активности семейств Twist и Slug/Snail для эпи­телиально-мезенхимального перехода клеток [24].

В прогрессировании метастазов РЯ важную роль игра­ет не только состав специфических молекул, но и меха­нические свойства БС, так как более жесткий матрикс обладает большей предрасположенностью к росту и развитию метастазов РК [26]. Неблагоприятный ис­ход у больных РЯ связан со взаимодействием выра­батываемого клетками РЯ интегрина альфа 2 (ITGA2) с коллагеновыми волокнами, обильно представленны­ми в опухоли. ITGA2 запускает адгезию раковых кле­ток к коллагену и способствует их миграции, мезотелиальному клиренсу и устойчивости к аноикису [27]. Экзосомы, происходящие из клеток РЯ и транспорти­руемые к мезотелиоцитам брюшины человека, оказа­лись обогащенными гликопротеинами клеточной по­верхности CD44. Это способствует инвазии рака путем индукции секреции ММР9 и очищения мезотелиального барьера для усиления инвазии клеток РЯ. При пода­влении экспрессии CD44 экзосомы оказывают меньшее влияние на мезотелиоциты [28]. CD44, или хоумингассоциированные CAM (cell adhesion molecules), — это семейство трансмембранных гликопротеинов, включая несколько изоформ (в зависимости от особенностей внеклеточного домена за счет комбинаций 10 вариан­тов экзонов), экспрессируемых в эпителиальных, эндо­телиальных и опухолевых клетках. CD44 используются как рецепторы гиалуроната (гликозаминогликана, от­ветственного за пролиферацию и подвижность кле­ток). Кроме того, CD44 регулируют клеточную адге­зию при взаимодействии с остеопонином, коллагеном, ММР и селектинами. Доказана выраженная экспрессия CD44 неопластическими клетками, что связано с опу­холевой инвазией, миграцией и ангиогенезом [29]. Прометастатические изменения в эндотелии БС, необ­ходимые для ангиогенеза, имеют решающее значение в метастазировании РЯ. При исследовании БС боль­ных с метастазами РЯ высокой степени злокачествен­ности была определена повышенная экспрессия ММР9 и VEGFA как в эндотелии, так и в мезотелии по сравне­нию со здоровым контролем [30]. Обнаружено, что мета­статические клетки РЯ в сальнике способны экспресси­ровать VEGFR3, подобно эндотелиоцитам, стимулируя неоваскуляризацию и прогрессирование опухоли [6]. Получены данные о роли VEGF в развитии РЯ в кли­нических исследованиях с использованием различных методов. Иммуногистохимический (ИГХ) анализ по­казал повышенный уровень VEGF и VEGFR при РЯ по сравнению с контролем, а также позитивную ассо­циацию с метастазами [31]. При помощи генетических методов также было обнаружено, что профили экспрес­сии VEGF рецепторов и их лигандов значительно выше при метастазах в БС. В связи с этим определение уров­ней VEGF имеет прогностическое значение при РЯ [32].

Роль систем адгезии в метастазировании рака яичника в большой сальник

Взаимодействие клеток РЯ с микроокружением БС играет ключевую роль в метастазировании и прогрес­сировании болезни. В регуляции данных процессов участвуют системы сигналинга молекул адгезии, вли­яющих на пролиферацию, миграцию и выживаемость раковых клеток [33]. К основным типам белков клеточ­ной адгезии относятся иммуноглобулины, интегрины, кадгерины, селектины и хоуминговые рецепторы лей­коцитов [34]. Их главная роль состоит в формирова­нии межклеточных контактов. Прикрепление раковых клеток к экстрацеллюлярному матриксу происходит главным образом благодаря интегринам, а к мезотелиальным слоям опосредуется такими молекулами адге­зии, как ICAM-1 (intracellular cell adhesion molecule-1) и VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule 1) [9]. При инициировании туморогенеза клетки РЯ претерпевают эпителиально-мезенхимальный переход, при котором изменяется экспрессия кадгерина и интегрина с акти­вацией протеолитических путей. С током перитонеаль­ной жидкости сфероиды раковых клеток преодолевают аноикис и прикрепляются преимущественно к БС, где они возвращаются к своему эпителиальному феноти­пу. Начальные стадии метастазирования регулируются контролируемым взаимодействием рецепторов адгезии и протеаз, а поздние метастазы характеризуются бы­стрым ростом опухолевых узелков на покрытых мезотелием поверхностях [3].

Межклеточная адгезия опосредуется кадгеринами через кальций-зависимые гомофильные взаимодей­ствия их внеклеточного домена, который связывается с молекулами адгезии соседних клеток, а внутрикле­точный домен (цитоплазматический хвост) образует соединения с цитоскелетом и цитоплазматическими белками, такими как катенины [33]. Наиболее часто в межклеточных контактах участвуют «классические» кадгерины, которые играют роль в метастазировании. К ним относятся E-кадгерин (эпителиальный), P-кадгерин (плацентарный), N-кадгерин (нейрональ­ный), VE-кадгерин (сосудистый эндотелиальный). Наиболее изученным является Е-кадгерин, который ис­пользуется в качестве прогностического маркера опу­холевого роста [35] (рис. 1).

Рисунок 1. Схема участия Е-кадгерина в формировании межклеточных взаимодействий
Figure 1. Participation of E-cadherin in the formation of intercellular interactions

В эпителиальных тканях гомофильное Е-кадгериновое лигирование может регулировать локализацию и функ­цию Rho ГТФазы с помощью механизма «передачи сигналов извне внутрь». Переключение экспрессии с Е­на N-кадгерин является важным индикатором прогрес­сирования рака, так как облегчает эпителиально-ме­зенхимальный переход, приводящий к образованию раковых клеток с большими миграционной и инвазив­ной способностями. В метастазирующих солидных опу­холях экспрессия Е-кадгерина обычно теряется в связи с онкосупрессорной функцией этой молекулы за счет ингибирующего воздействия на рецептор эпидермаль­ного фактора роста (EGFR). Напротив, N-кадгерин, несмотря на сходные структурные и функциональные свойства, ассоциирован с агрессивностью и химиоре­зистентностью злокачественных новообразований [33]. Е-кадгерин является также объектом воздействия друих молекул, участвующих в регуляции опухолевого роста при РЯ. Так, активин-А, уровни которого положитель­но коррелируют с худшим прогнозом при РЯ, подавляет экспрессию гена Е-кадгерина. Этот эффект устраняется при ингибировании или нокдауне рецептора активина 1-го типа. Кроме того, активин-А стимулирует экспрес­сию транскрипционных факторов SNAIL и SLUG, кото­рые подавляют синтез Е-кадгерина [36]. Снижение экс­прессии гена Е-кадгерина сопровождается ослаблением синтеза интегрина α6β4, участвующего в формировании гемидесмосом. В результате клетки обретают способ­ность к активной миграции и инвазии. Потеря плот­ных межклеточных и клеточно-базальных мембранных соединений, опосредованных Е-кадгерином и интегрином а6р4, приводит к возникновению N-кадгеринзависимых соединений, обусловленных pi и р3 интегринами. Такие изменения наделяют клетку повышенным тропизмом к коллагену соединительной ткани. Также N-кадгерин усиливает передачу сигналов факторов ро­ста фибробластов и модулирует сигнальный путь Wnt, что индуцирует метастазирование [37].

Семейство интегринов представлено рецепторами, об­разованными двумя трансмембранными гликопротеи­нами, и включает в себя 24 формы гетеродимерных мо­лекул, сформированных комбинациями восемнадцати α-субъединиц и восьми β-субъединиц. При интегринкадгериновых взаимодействиях кадгерины индуциру­ют злокачественный фенотип и инвазивные свойства раковых клеток, а интегрины регулируют активную миграцию клеток, деградацию экстрацеллюлярного ма­трикса, интравазацию и экстравазацию. Внеклеточный домен β-субъединицы интегрина содержит актив­ный центр связывания двухвалентных ионов кальция или магния [37]. Большинство интегринов связывается с актиновым цитоскелетом посредством цитоплазмати­ческих линкерных белков, таких как таллин, винкуллин, паксиллин (рис. 2) [34]. Благодаря таким двусторонним связям интегринов обеспечиваются изменения под­вижности клеток в ответ на преобразования межкле­точной среды. Также интегрины обеспечивают коллек­тивную клеточную адгезию, соединяясь с веществами внеклеточного матрикса и препятствуя дезинтеграции клеточных колоний. Они участвуют в инвазии раковых клеток и передаче онкогенных сигналов на рецепторы факторов роста и определяют локализацию будущих метастазов [37].

Рисунок 2. Схема строения интегринов
Figure 2. Structure of integrins

Одной из характеристик солидных опухолей является снижение уровня кислорода, которое приводит к на­коплению белка HIF-1, инициирующего синтез VEGF. Последний стимулирует экспрессию иммуноглобулин-подобных молекул адгезии (Ig-CAM) ICAM-1, VCAM-1, PECAM-1 в эндотелиоцитах, которые яв­ляются поверхностными лигандами для интегринов. Иммугоглобулины, в свою очередь, активируот вы­работку MMP, которые вызывают деградацию экстра целлюлярного матрикса, необходимую для начальных этапов метастазирования [38]. Сосудистая сеть в млеч­ных пятнах содержит индикаторы ангиогенеза, к кото­рым относятся CD105⁺ сосуды и сосудистые отростки. Мезотелиальные клетки на вершине иммутаых агре­гатов секретируют VEGF-A. Поэтому метастатические опухолевые клетки преимущественно растут на участ­ках, богатых проангиогенными сосудами, стимулиру­емыми ангиогенными факторами мезотелиоцитов [7]. К молекулам сосудистой адгезии, способствующим взаимодействию раковых клеток с иммуноцитами при метастазировании рака, относятся L-селектин (син­тезируется лейкоцитами), E-селектин (вырабатывается эндотелиальными клетками) и P-селектин (продуциру­ется тромбоцитами и эндотелиоцитами). Их главная функция — привлечение и отбор лейкоцитов в места воспаления или в лимфоидные ткани. Однако они так­же участвуют в передаче сигналов внутриклеточных и внеклеточных систем и способствуют метастазированию путем рекрутирования миелоидных клеток [39]. P-селектин опосредует адгезию тромбоцитов и опухо­левых клеток, L-селектин облегчает привлечение кле­ток, происходящих из миелоидных клеток, и вместе с E-селектином способствует эффективной экстравазации злокачественных клеток. В качестве медиаторов соединения селектинам требуются специфические углеводы, такие как Р-селектин-гликопротеиновый лиганд-l (PSGL-1), сиалированные олигосахариды сиалил-Льюис a (sLe^a) и x (sLe^x) [29]. На начальных этапах рекрутирования лейкоцитов, L-селектины, синтезируе­мые Т-лимфоцитами, совместно с Р- и Е-селектинами эндотелиальных клеток, взаимодействуют с эндотели­альными и лейкоцитарными углеводными лигандами. В результате ICAM, CAMl, VCAM-1, совместно с интегринами, усиленно синтезируются для обеспечения прочного прикрепления клеток и передачи внеклеточ­ных сигналов во время трансэндотелиальной мигра­ции. После достижения стабильности межклеточных соединений интегрины β₁, β₄, ICAM, CAM1, VCAM-1 активируются для дальнейшего усиления первичных связей селектина и передачи сигналов для колонизации здоровой ткани [38]. Метастазирование РЯ иницииру­ется взаимодействиями селектинов с лигандами, после которых происходят взаимосвязи интегринов с экстрацеллюлярным матриксом [40]. При РЯ альтернативно активируемые макрофаги влияют на адгезию раковых клеток к мезотелиоцитам за счет синтеза MIP-1β, кото­рый активирует передачу в них сигналов CCR5/PI3K. Это приводит к экспрессии Р-селектина на поверхно­сти мезотелиоцитов. В результате раковые клетки при­соединяются к этому de novo Р-селектину через CD24, что приводит к усилению их адгезии [41].

Роль большого сальника в защите от прогрессирования рака яичника

Несмотря на наличие большого количества иссле­дований, свидетельствующих об участии клеток БС в опухолевой прогрессии при РЯ, имеется ряд данных о наличии специфических клеток, ингибирующих кан­церогенез в БС. Исследования в данном направлении перспективны как для использования морфологиче­ских исследований в прогнозировании исхода у боль­ных с метастазирующим РЯ, так и для разработки таргетной терапии в персонализированной медицине. БС является областью лимфопоэза В1 клеток и иммуного ответа на независимые от Т-клеток антигены. Несмотря на отсутствие фолликулярных дендритных клеток, в БС антигены и клетки из брюшной полости поддержива­ют зависимые от Т-лимфоцитов В-клеточные ответы, включая переключение изотипа, соматическую гипер­мутацию и ограниченное созревание аффинности. Кроме того, в БС поддерживается ответ CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов на перитонеальные антигены и рекру­тируются эффекторные Т-клетки, праймированные в друих областях. В отличие от обычных лимфоид­ных органов, МП развиваются без клеток-индукторов лимфоидной ткани, но нуждаются в хемокине CXCL13 [42]. С одной стороны, МП большого сальника являют­ся цитотоксическими против раковых клеток, демон­стрируя противоопухолевый эффект. С другой сторо­ны, они служат высокоэффективным «естественным фильтром» для скрининга раковых стволовых клеток, обеспечивая тем самым микросреду, в которой рако­вые клетки формируют метастатические очаги. Этот феномен связан со способностью макрофагов в раз­личных частях опухоли высвобождать факторы роста, хемокины, ферменты, регулирующие рост опухоли, ангиогенез, инвазию и метастазы. Эти макрофаги ми­грируют в МП через кровеносные сосуды под влиянием хемоаттрактантов опухолевого происхождения, к кото­рым относятся CF-1/M-CSF (колониестимулирующий фактор), хемокины СС и VEGF. Затем они дифферен­цируются в опухоль-ассоциированные макрофаги, ко­торые подразделяют на М1 (провоспалительный и про­тивоопухолевый эффекты) и М2 (иммуносупрессия и стимуляция опухолевого ангиогенеза и метастазов) [9]. Во время опухолевой прогрессии макрофаги про­являют значительную степень пластичности в отноше­нии фенотипического переключения с М1 на М2 [43]. Поэтому определение факторов, регулирующих дан­ные превращения фенотипов, могло бы стать основой для разработки новых методов противоопухолевого воздействия.

Первоначально колонизация опухолевых клеток РЯ вызывает увеличение количества и размеров МП, главным образом путем рекрутирования макрофагов из перитонеальной полости. Несмотря на это, раковые клетки продолжают расти, что может быть обусловле­но дефектом в иммунном распознавании или иммуносупрессивным эффектом [8]. Однако наличие Т-клеток внутри РЯ коррелирует с лучшим клиническим исхо­дом при запущенных РЯ [44]. Более того, присутствие CD8⁺ Т-лимфоцитов как в первичном РЯ, так и в ме­тастатических опухолях в БС ассоциируется с лучшей выживаемостью пациентов, а отсутствие инфильтра­ции опухоли Т-клетками приводит к неэффектив­ности лечения РЯ [45][46]. CD8⁺ клетки являются ци­тотоксическими лимфоцитами, которые «убивают» клетки-мишени за счет синтезируемых ими фермен­тов, таких как гранзим-В. CD4+ клетки обычно не яв­ляются цитотоксичными, но способны рекрутировать и активировать другие клетки, такие как макрофаги,

В-лимфоциты, дендритные, воспалительные клет­ки и другие Т-лимфоциты. Выявлена положительная корреляция инфильтрации опухоли CD4⁺ клетками с выживаемостью без прогрессирования и с общей выживаемостью пациентов с РЯ [47]. Генетические исследования показали хороший прогноз у больных с РЯ при экспрессии тканью РЯ хемокиновых лигандов (CXCL10, CXCL11) и рецепторов (CXCR3) для CD8⁺ Т-лимфоцитов [48]. С худшим прогнозом при РЯ кор­релирует накопление CD33⁺ миелоидных супрессор­ных клеток в БС (под влиянием VEGF), которое ве­дет к неспособности накапливать CD8+ клетки [49]. Злокачественные новообразования чувствительны к иммунитету, опосредованному натуральными килле­рами (NK) [50]. В экспериментах in vivo на модели ксе­нотрансплантата мыши показана эффективность вы­сокоактивных NK, полученных из человеческих CD34+ гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток, в инфильтрации и опосредованном уничтожении сфе­роидов РЯ [51].

Морфофункциональные исследования большого сальника при раке яичника

Несмотря на наличие большого количества работ по изучению метастазирования РЯ в большой сальник, данная проблема остается актуальной, так как уровень смертности при РЯ сохраняется высоким [1]. Поэтому разрабатываются различные методики исследования БС с целью определения механизмов, лежащих в осно­ве прогрессирования РЯ для возможного таргетного воздействия. Применяют биопсию БС с микроскопией и ИГХ, определение плотности клеток и механических свойств, цитокинов, белков ЭЦМ и профилей РНК. Комплексное применение данных методик показало положительную корреляцию между глобальной кле­точной пролиферацией (измеренной с помощью Ki67) и уровнями LTA, IL17A, IL15, CXCL10, а также ассоци­ацию РЯ с IL12B, IL13, IL16, VEGF, CCLs11, 26, CXCL10 [52]. Важная роль исследований БС заключается в опре­делении прогноза не только у больных РЯ, но даже у здоровых женщин с повышенным риском развития РЯ (например, у носительниц герминативных мутаций в онкосупрессорных генов BRCA1, BRCA2), несмотря на проведение им профилактической сальпинго-оофорэктомии. Это связано с возможным ростом клеток РЯ, находящихся в БС у данных женщин [5]. Поэтому оп­тимизация морфофункционального анализа большого сальника позволит выявить специфические гистологи­ческие маркеры, которые станут основой для молеку­лярного скрининга риска развития метастатического РЯ у данной категории пациентов.

Но наибольшее значение имеет изучение БС у больных РЯ с имеющимися метастазами. Для исследования функ­ции МП в норме и при канцероматозе используется ши­рокий ряд биофизических и биохимических методов. При световой микроскопии с окраской гематоксилин­эозином с увеличением ×100, ×200, ×400, млечные пятна визуализируются непрозрачными, круглой или оваль­ной формы, диаметром от 349 до 756 мкм. Их плотность в БС уменьшается с возрастом и составляет от 40-50 на см² у новорожденных до 10 см² в возрасте старше 70 лет. Диаметр макрофагов неправильной формы в МП составляет 15-20 мкм, Т-лимфоцитов — 7-10 мкм. С помощью сканирующей электронной микроскопии было обнаружено, что макрофаги активированных МП заметно изменяют свою мембранную активность и мигрируют через межклеточные устья мезотелиальных клеток в брюшную полость [9]. Для количествен­ного подсчета МП в большом сальнике используются специальные программы, такие как ImageScope версии 11.1.2.752 (Aperio) [10]. Для исследования клеточного состава МП используется метод жидкостной цитоме­трии: выделение клеток производят путем измельчения БС в 0,2 %-ном растворе коллагеназы и вращения в те­чение 45 минут при 37 ^оС. Диссоциированные клетки окрашивают анти-СD45 для идентификации гемопоэ­тических клеток, а также антителами, специфичными для дополнительных маркеров, таких как CD8 и CD4 [6]. Для определения роли жесткости экстрацеллюлярного матрикса БС и его влияния на различные аспекты мор­фологии и миграции клеток при РЯ применяется метод атомно-силовой микроскопии с измерением значения модуля Юнга. Благодаря этому методу было выявлено, что распространение раковых клеток и формирование очагов адгезии увеличивается на более жестких матри­цах. Помимо определения механических характеристик, данный метод позволяет получить изображения биоло­гических образцов с высоким разрешением [26].

Для оценки состояния сосудов при РЯ используют такие маркеры, как CD34 (применяют панэндоте­лиальные антитела, нацеленные против них). При определении роли плотности микрососудов при РЯ с помощью CD34 было показано повышение показа­телей выживаемости и выживаемости без прогрессии при высокой плотности микрососудов [53]. У пациен­тов с РЯ количество циркулирующих CD34 и VEGFR3+ клеток значительно выше, чем у здорового контроля [54]. В связи с ролью Е-кадгерина в подавлении ро­ста РЯ применяются такие методики его определения, как ПЦР в реальном времени, секвенирование нового поколения (NGS) и ИГХ анализ. Последний метод яв­ляется высокочувствительным и наиболее простым, так как не требует использования дорогостоящего обо­рудования [55]. Для РЯ высокой степени злокачествен­ности высокоспецифичны мутации гена ТР53, наличие которых является маркером для дифференциальной диагностики с РЯ низкой степени злокачественности. Помимо идентификации мутаций гена ТР53, при из­учении РЯ широко применяется ИГХ белка р53. Если необходимо выявить наличие мутантного белка (без идентификации конкретных изменений в последова­тельности нуклеотидов), чувствительность данного метода составляет 96 % при сравнении с результатами NGS. Плоскоклеточные карциномы и муцинозный РЯ проявляют феномен терминальной дифференцировки, когда базальные клетки демонстрируют аномаль­ный паттерн ИГХ р53, а апикальные — нет, несмотря на наличие мутации ТР53. Метод ИГХ р53 может быть использован для молекулярного тестирования РЯ, так как раковые клетки с мутацией в гене ТР53 не содержат управляющих раком транслокаций [56]. Другим про­гностическим биомаркером, ассоциированным с агрес­сивностью РЯ, является Ki67. Параметры индекса Ki67 могут использоваться для корреляции данных ПЭТ-КТ [57]. Этот белок расположен в ядрах клеток, а его синтез тесно связан с ростом и размножением клеток, поэтому широко применяется в рутинных патологических ис­следованиях в качестве маркера пролиферации. Ki67 является установленным прогностическим индикато­ром для оценки биопсий от больных РЯ. Клинически доказано, что Ki67 коррелирует с метастазированием и стадией опухоли, а экспрессия гена этого белка значи­тельно выше в злокачественных тканях с низкодиффе­ренцированными клетками [58].

Перспективы исследований большого сальника для терапии рака яичника

Морфофункциональное изучение БС при РЯ может стать основой для разработки новых путей терапии РЯ. В данном отношении перспективны иммунные стратегии для нацеливания на специфические участ­ки БС и повышения местного противоопухолево­го иммунитета, основанные на полученных данных о факторах метастазирования. Так, рост метастазов РЯ в большом сальнике может замедляться за счет сти­муляции опухолевого антиген-специфического ответа CD8⁺ Т-клеток при помощи фагоцитов, нагруженных антигеном липосом, покрытых олигоманнозой [59]. Выявленная роль NET в инициации колонизации кле­ток РЯ в большом сальнике стала основой для пред­ложения ингибиторов PAD4 (пептидиларгинин деаминаза — фермент, необходимый для формирования NET) для подавления колонизации БС [20]. Мишенью таргетной терапии РЯ может стать FABP4, играющий ключевую роль в метастазировании РЯ в большой сальник [22]. Предполагается использование ингиби­торов CD36 для эффективной терапии метастазов РЯ [23]. Перспективным подходом к терапии РЯ являет­ся адаптивный перенос аллогенных NK [51]. Большое количество цитостатических NK может быть получено из различных источников, включая пуповинную кровь. Терапия при помощи NK является перспективной стра­тегией в лечении рака, так как позволяет избирательно воздействовать на раковые клетки без нанесения вреда здоровым тканям [50]. Данные механизмы активно из­учаются. Было показано, что активация путей Wnt/p-катенина вносит вклад в формирование «холодного» иммунного фенотипа клеток, окружающих опухоли, которые характеризуются слабой эффективностью при терапии блокадой иммунных контрольных точек (ICB). Для лечения данного типа РЯ предложено исполь­зование CGX-1321, ингибитора Wnt-путей, который обладает противоопухолевой и иммунностимулирую­щей активностями, а также значительно снижает опу­холевую нагрузку и повышает уровни CD8⁺ Т-клеток при РЯ [60]. Одним из перспективных путей тера­пии метастатического РЯ может стать специфическое ингибирование ITGА2-опосредованных взаимодей­ствий раковых клеток с коллагеном или таргетная те­рапия фокальных сигналов адгезии [27]. Подавление колонизации БС раковыми клетками возможно также за счет ингибирования CCR1 [5]. Представляет интерес разработка способов воздействия на пластичный меха­низм переключения фенотипов ассоциированных с РЯ макрофагов из М2 (потенцирует рост метастазов) в М1 (противоопухолевый эффект) [43].

Заключение

РЯ является одним из наиболее распространенных зло­качественных новообразований женской репродуктив­ной системы с самой высокой смертностью вследствие бессимптомного течения и диагностики на поздних стадиях. Этим обусловлена низкая эффективность применяемых способов лечения РЯ, несмотря на хи­рургическое удаление БС, преимущественной области метастазирования данной опухоли. Перспективным на­правлением в терапии РЯ может стать редактирование противоопухолевых иммунных механизмов. Об этом свидетельствуют данные о лучшей выживаемости жен­щин с наличием CD8⁺ клеток в самом РЯ и метастазах в БС, несмотря на проведенную оментэктомию, так как клетки иммунной системы формируют иммунологи­ческую память для защиты организма от раковых клеток. Поэтому подробное исследование механизмов форми­рования противоопухолевого ответа при РЯ играет важ­ную роль в разработке стратегий воздействия на данную патологию. Имеющиеся в научной литературе данные многочисленных исследований показали, что важную роль в метастазировании РЯ играют млечные пятна БС. Они отличаются от обычных лимфоидных органов спец­ифическим клеточным составом с преобладанием IgM^hiIgD^lo лимфоцитов, наличием активных CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток и отсутствием фолликулярных дендритных клеток. Участие БС в метастазировании РЯ характери­зуется свойствами, как способствующими колонизации раковых клеток, так и защищающими от опухолевой инвазии (табл. 1). Активация макрофагов (синтезируют хемокины CCL23) и нейтрофилов в БС, способствующих метастазированию РЯ, связана с воздействием выраба­тываемых раковыми клетками рецепторов (CD36) и вос­палительных факторов (IL-8, MCP-1, GRO-α и GRO-β). Адипоциты БС служат источниками энергии для рако­вых клеток, а также потенцируют миграцию, инвазию и хоуминг РК за счет синтеза IL-8, FABP4. В таблице 1 представлены наиболее важные факторы, влияющие на метастазирование РЯ в большой сальник. Они могут быть использованы в качестве мишеней для разработки путей терапевтического воздействия при РЯ. Важную роль в распространении раковых клеток в БС играют молекулы адгезии, многие из которых обладают стиму­лирующим влиянием на прогрессирование РЯ (ICAM-1, VCAM-1), но некоторые, такие как кадгерин-Е, обладают противоопухолевым действием.

Таблица 1. Факторы, регулирующие метастазы рака яичника в большой сальник
Table 1. Factors regulating metastases of ovarian cancer to the greater omentum