Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия в диагностике онкологической патологии: современные аспекты и перспективы применения

Введение

В последние годы дерматологические технологии визуализации сосредоточены на разработке оптических неинвазивных диагностических методик для повышения точности диагностики и преодоления недостатков инвазивного гистологического исследования кожных покровов. Из всех перспективных инструментов, используемых in vivo, только конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ) позволяет визуализировать кожные структуры с разрешением изображения, очень близким к разрешению световой микроскопии, тем самым выполняя «оптическую биопсию» слоев кожи [1]. Данная неинвазивная технология позволяет оптически разделить кожу на слои различной глубины, не требуя при этом специальной обработки или окраски тканей [2]. Конфокальная микроскопия неинвазивно демонстрирует ядерную и клеточную морфологию в коже человека in vivo. При оптическом разрезе 2–5 мкм и разрешении 0,5–1,0 мкм регулярно выполняется визуализация эпидермиса и папиллярной дермы в небольших полях зрения, как правило, 0,5 × 0,5 мм и до глубины 100–200 мкм [3]. Визуализация основана на обнаружении единичных обратно рассеянных фотонов из оптического среза, а контраст обусловлен относительными изменениями показателей преломления и размеров органелл и микроструктур. Сильный сигнал и яркий контраст изображения получаются, в частности, от эпидермальных и дермальных структур (меланин, кератин и коллаген). Визуализация осуществляется в плоскостях, ориентированных параллельно поверхности кожного покрова. Несмотря на то что глубина исследования не превышает 200 мкм, она позволяет исследовать кожно-эпидермальный переход, который обычно находится на глубине 50–150 мкм. Для дерматоонкологов кожно-эпидермальный переход представляет ключевой интерес, так как почти все раковые заболевания кожи возникают и распространяются из базального слоя эпидермиса в этом месте. Поскольку КЛСМ позволяет многократно проводить визуализацию одного и того же участка кожи в режиме реального времени (в различные временны΄е интервалы), представляется возможным мониторировать процессы прогрессирования новообразования кожи, эффективности его лечения и изучения динамического поведения онкологического процесса в коже [3][4][5].

Конфокальная микроскопия в дерматоонкологии

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия может выполняться в современных условиях в режиме флуоресцирования или отражения изображения. Флуоресцентная конфокальная микроскопия (ФКМ) требует введения флуоресцентного агента для создания контраста в новообразовании. Эта технология используется преимущественно в экспериментальных исследованиях на поврежденных очагах кожного покрова [6]. Отражательная конфокальная микроскопия (ОКМ) основана на различиях в показателях преломления клеточных структур и широко применяется в настоящее время как неинвазивная оценка меланоцитарных и немеланоцитарных опухолей кожи [7][8]. Данный метод демонстрирует хорошую корреляцию с результатами дерматоскопического и гистологического исследований. В ряде исследований сообщалось, что КЛСМ позволяет достичь чувствительности 70–92 % и специ­фичности 84–88 % для меланоцитарных поражений и чувствительности 92–100 % и специфичности 85–97 % для немеланоцитарных поражений кожи [5]. Хотя чувствительность метода КЛСМ сопоставима с чувствительностью дермоскопии, специфичность ее в два раза выше (особенно для слабопигментированных, непигментированных меланоцитарных и немеланоцитарных новообразований кожи). Такие поражения часто не дают специфических особенностей при проведении дермоскопии. Было установлено, что визуализация с помощью КЛСМ особенно диагностически значима для выявления гипомеланотических и амеланотических вариантов меланом (беспигментные формы), достигая чувствительности до 85 % и специфичности до 84 % [5]. Имеются сообщения, что конфокальная микроскопия как исследование второго уровня после дерматоскопии может значительно уменьшить количество диагностических биопсий доброкачественных образований кожи, практически на 50–68 %. Кроме того, дермоскопия в сочетании с визуализацией КЛСМ может достигнуть высокой чувствительности, до 98 % [8].

Этот неинвазивный метод оказался достаточно успешным при диагностике некоторых воспалительных заболеваний кожи, а также для исследования различных динамических процессов в коже. В частности, имеются исследования по успешному применению ОКМ при процессах регенерации кожи после повреждения, оценки кровотока дермальных слоев и тканевой миграции иммунокомпетентных клеток в режиме реального времени в ответ на различные раздражители [9][10].

В настоящее время ОКМ in vivo считается наиболее перспективным методом неинвазивной визуализации для морфологической и динамической характеристики кожных новообразований. С помощью ОКМ появилась возможность определения четких границ опухолевого процесса перед хирургическим иссечением новообразований кожи или другими методами инвазивной терапии [11].

На сегодня уже разработаны современные многослойные приборы, комплексно сочетающие КЛСМ в режиме отражения и флуоресценции, что значительно повышает диагностические показатели выявления, контроля и динамического наблюдения за новообразованиями кожи по сравнению с использованием каждого варианта диагностического прибора в отдельности [12].

Для понимания перспективных возможностей использования ОКМ при диагностике злокачественных новообразований кожи рассмотрим применение этого метода при конкретных дерматоонкологических нозологиях.

Базальноклеточный рак (БКР) является наиболее распространенным злокачественным новообразованием из всех видов рака кожи. В научной литературе указывают на рост заболеваемости БКР с темпом прироста около 10 % ежегодно во всем мире [13]. Стандартно для подтверждения диагноза БКР необходимо гистологическое исследование биоптата кожи, несмотря на инвазивность процедуры и ее экономические затраты. Ранняя диагностика БКР имеет первостепенное значение, так как частой локализацией этой опухоли являются визуально видимые участки кожного покрова (лицо). Локально деструктивный характер опухоли может привести к обезображиванию пораженных участков кожного покрова, что обуславливает актуальность ранней диагностики БКР [14]. В современной литературе описаны диагностические особенности ОКМ для различных клинических вариантов и типов БКР, демонстрирующие хорошую корреляцию с определенными дерматоскопическими и гистопатологическими данными [15]. Скопление агрегатов базальных клеток БКР располагаются на стыке дермы и эпидермиса в пределах базальной мембраны, которые хорошо визуализируются на изображении ОКМ либо в виде «ярких опухолевых островков» — шнуровидных структур, окруженных расщелинообразными темными пространствами, либо в виде «темных силуэтов» — гипорефлекторных темных участков, очерченных светлой соединительной тканью [15]. Эти агрегаты базальных клеток часто имеют ядра, ориентированные вдоль одной оси, демонстрируя «периферическое палисадирование» по периферии опухолевых островков [16]. Кроме того, при БКР в дерме могут присутствовать на изображении ОКМ выпуклые и извилистые кровеносные сосуды с интенсивным движением лейкоцитов, а также многочисленные воспалительные клетки различной формы и размеров (лимфоциты, меланофаги), окружающие гнезда опухоли. Внутри агрегатов базальных клеток в пигментированном БКР можно выделить яркие дендритные структуры, соответствующие дендритным меланоцитам [17].

В ретроспективном многоцентровом исследовании, проведенном Nori et al. (2004), оценивалась чувствительность и специфичность пяти критериев БКК на изображении ОКМ. В частности, были выделены: клеточный полиморфизм вышележащего эпидермиса, участки опухолевых клеток с удлиненными мономорфными ядрами, поляризация ядер, повышенная дермальная васкуляризация и выраженный воспалительный инфильтрат. Идентификация двух или более из этих пяти критериев показала высокую чувствительность (100 %) метода ОКМ для диагностики БКК. Из этих критериев наиболее чувствительными оказались удлиненные мономорфные ядра и поляризация ядер [16], позволяющие достоверно подтвердить (выявить) БКК. Кроме того, эта новая технология может быть диагностическим руководством в определении границ поражения для хирургического иссечения или лазерной абляции очага базальноклеточного рака кожи.

Плоскоклеточная карцинома (ПКК) является вторым наиболее частым немеланомным раком кожи после БКК и появляется преимущественно на открытых участках кожи [18][19]. Помимо ультрафиолетового облучения, в патогенезе ПКК предполагается участие различных триггерных факторов риска (вирусные инфекции, воздействие химических агентов, нейроэндокринные факторы, хроническое воспаление). Плоскоклеточный рак кожи имеет различные клинические проявления, включая рак in situ (болезнь Боуэна), инвазивные поверхностные очаги и инфильтративные очаги [20]. Актинический кератоз (АК) является наиболее распространенным предраковым поражением кожи с риском прогрессирования до ПКК, с вероятностью в 5–10 %, но некоторые исследователи рассматривают актинический кератоз как раннее проявление ПКК [21].

При оценке ПКК и гипертрофической формы АК методом отражательной конфокальной микроскопии выявляется выраженный гиперкератоз, который значительно ограничивает глубину проникновения. В связи с сильным обратным отражением от богатой кератином поверхности опухоли возникает бледность изображений [22]. Более выраженный беспорядочный сетчатый рисунок в зернистом слое эпидермиса и наличие неопластических очагов в дерме позволяют отдифференцировать ПКК от АК. Кроме того, когда при ПКК толщина поражения позволяет визуализировать дермоэпидермальное соединение, дермальные сосочки могут казаться удлиненными с петлевыми, круглыми сосудами внутри них, что также может обуславливать диагностические критерии [23]. Однако в случае инфильтративных поражений уровень инвазии обычно недоступен при использовании конфокальной микроскопии. Даже при ex vivo КЛСМ во время операции, обнаружение остатков ПКК редко представляется возможным также из-за неотражающих особенностей кератинизации. В исследовании M. Lupu et al. (2018) были описаны определенные отличительные особенности ПКК, локализованного на губах: выраженное нарушение структуры базального слоя, обширная атипия кератиноцитов, округлые, расширенные и извитые кровеносные сосуды, сопровождающиеся периваскулярными воспалительными инфильтратами, кожный солнечный эластоз и обильная воспалительная инфильтрация [23]. Более того, КЛСМ имеет потенциал для дифференциации особенностей нормальной слизистой оболочки, дисплазии и ПКК губы в режиме реального времени и поэтому может быть широко использована для предоперационной оценки полей резекции опухоли.

Актуально применение ОКМ и в диагностике меланоцитарных поражений. Меланома кожи является одним из наиболее агрессивных злокачественных новообразований человека, связанной с высокими показателями смертности, несмотря на последние достижения в терапии [24][25]. Особенно важным является наблюдение за пациентами высокого риска, у которых меланому сложно отличить от невуса. Поэтому если дерматолог сталкивается с поражением, подчиняющимся дерматоскопическому правилу ABCDE или если атипичное поражение является одиночным, то особых трудностей диагностика меланомы не вызывает. И наоборот, у пациентов с многочисленными атипичными невусами визуально идентифицировать поражение с наибольшим количеством признаков, которые могут представлять собой новую или развивающуюся меланому, практически невозможно. Удаление большого количества невусов у таких пациентов для выявления одной меланомы может быть скрининговым методом, хотя имеются обширные публикации о том количестве невусов, которые следует удалить у пациентов высокого риска для выявления одной меланомы [26]. При данной патологии крайне необходимым было бы широкое внедрение ОКМ как неинвазивного инструмента визуализации на клеточном уровне от поверхностных поражений меланомы до дермальных слоев.

Меланоцитарные очаги имеют в своем составе атипичные меланоциты, атипичные очаги в дермоэпидермальном соединении и атипичные зародышевые клетки в дерме. Преимущество исследования ОКМ in vivo в режиме реального времени играет роль также в случае диагностики атипичной беспигментной формы меланомы. Эта технология позволяет проводить неинвазивный мониторинг течения заболевания и контроль терапии злокачественного новообразования [27]. Исследования, посвященные применению этой технологии в диагностике меланомы, показали, что меланоцитарные опухолевые клетки могут быть четко дифференцированы от немеланоцитарных. Например, доброкачественные невусы имеют мономорфные, округлые клетки с яркой окраской, а в меланомах клетки менее яркие, неправильной формы, с разветвленными отростками. В добро­качественных невусах можно найти очаги соединительнотканных клеток и нормально расположенных дермальных меланоцитов, в то время как в меланоме наблюдается расстройство архитектуры и расположения меланоцитарных клеток. Границы кератиноцитов могут быть размыты или полностью отсутствовать при меланоме. Горизонтальные оптические срезы при ОКМ обеспечивают лучшую визуализацию морфологии меланомы, чем классические гистологические срезы, окрашенные гематоксилином и эозином [28].

Не менее актуальным является применение КЛСМ в диагностике кожных лимфом. Кожные лимфомы представляют собой гетерогенную группу лимфопролиферативных нарушений с вовлечением кожи, которые характеризуются клональной пролиферацией зрелых Т-лимфоцитов (>60 % всех случаев), В-лимфоцитов или NK-клеток [29]. Гистопатологическое исследование в сочетании с иммуногистохимией биоптата кожи является главным критерием диагноза, хотя последовательные биопсии часто необходимы, особенно в случае ранних стадий поражения. Имеются сообщения, что КЛСМ уже была использована для диагностики in vivo и терапевтического наблюдения за кожными Т-клеточными лимфомами, причем большинство исследований касались его наиболее распространенного типа — грибовидного микоза [29][30].

Грибовидный микоз (в частности, ранние очаги поражения) может имитировать широкий спектр эритематосквамозных заболеваний кожи, и его клиническая и гистопатологическая диагностика часто является сложной задачей. Наиболее часто регистрируемые при конфокальной микроскопии признаки грибовидного микоза коррелируют с гистопатологическими находками и включают в себя слаборе­фрактерные клетки (лимфоциты) и везикулоподобные пространства (скопления Pautrier) внутри эпидермиса, гипорефрактивные папиллярные кольца и расширенные капилляры с толстыми стенками на дермо-эпидермальном стыке [30]. Остальные результаты конфокальной микроскопии носят неспецифический характер и отражают гетерогенную клиническую и гистопатологическую картину поражения. Однако КЛСМ in vivo, по-видимому, является надежным альтернативным методом проведения биопсии кожи, что обуславливает уменьшение числа неудачных гистопатологических исследований при грибовидном микозе. В отличие от кожных Т-клеточных лимфом, на сегодня не описаны особенности визуализации и картина конфокальной микроскопии для диагностики В-клеточных и NK-клеточных лимфом.

Кроме широких диагностических возможностей конфокальная лазерная сканирующая микроскопия имеет перспективу применения в исследованиях по канцерогенезу кожи. Канцерогенез кожи — это сложный, многофакторный процесс и актуальная тема для серьезных исследований, учитывая постоянно растущую заболеваемость раком кожи. В дополнение к признанным генетическим и экологическим факторам, длительное воздействие провоспалительных цитокинов и хемокинов в рамках хронического воспаления экспериментально поддерживается в пользу инициации и прогрессирования рака кожи [24].

Проведение исследований химически индуцированного канцерогенеза кожи у мышей является одной из наиболее доступных и экономически эффективных моделей для анализа ранних изменений, участвующих в опухолевом процессе кожи. Двухэтапная модель канцерогенеза кожи была показана в развитии эпителиальных раков в исследовании Abel et al. (2009) на химически индуцированных мышах и применении КЛСМ [31]. Такое разграничение фаз позволяет наблюдать предраковые поражения, и это дает более надежные результаты при тестировании влияния факторов окружающей среды и лекарственных препаратов на опухоли кожи. Было сообщено, что КЛСМ в режиме отражения позволяет в реальном времени наблюдать аномальную архитектуру ткани, атипичные структуры и васкуляризацию, которые сопровождают различные опухоли кожи [31].

Более детальные современные исследования, направленные на оценку специфичности и чувствительности этой технологии, показали, что существует хорошая дифференциация между доброкачественными и злокачественными опухолями. Так, в различных исследованиях чувствительность данного метода варьировала от 90,42 до 97,62 %, а специфичность — от 96,67 до 100 % [32]. Данная оценка не имеет ограничений по возрасту, полу, этнической принадлежности и имеет высокую корреляцию с клиническими, дерматоскопическими и гистологическими результатами. Таким образом, диагностическая точность, чувствительность и специфичность методик КЛСМ стали хорошей основой для ее внедрения в практику для диагностики меланомы и других новообразований кожи. Эта новая технология приносит (кроме характеристик инвазивности) новые возможности картографирования сложных и атипичных форм меланом [33–38].

Несмотря на все преимущества применения КЛСМ в дерматоонкологической практике, существуют и некоторые ограничения. Наиболее существенным недостатком этой технологии является ограничение глубины проникновения лазера до 200–300 мкм глубины кожного покрова, что позволяет визуализировать только эпидермис и верхнюю часть дермы. Поэтому более глубокие части дермального слоя (сетчатые слои) и подкожно-жировую клетчатку визуализировать, используя имеющиеся в настоящее время конфокальные микроскопы, не представляется возможным [20]. Например, узловые формы меланомы имеют тенденцию к более глубокому поражению, чем максимальная глубина визуализации при КЛСМ, и могут быть диагностически пропущены [39]. Невусы с тяжелой атипией (диспластические и др.) могут привести к ложноположительным результатам, хотя в таких случаях обычно рекомендуется диагностическая биопсия с целью исключения меланомы, и такие полноценные очаги поражения, как правило, полностью удаляются. Можно пропустить малые очаговые зоны меланомы in situ в пределах более крупного поражения. Наличие клеток Лангерганса, которые не всегда могут быть дифференцированы от меланоцитарных клеток, также может привести к ложноположительным результатам. А наличие воспалительных инфильтратов в очагах поражения может скрывать клеточную морфологию лежащей в их основе меланомы. Некоторые поражения, такие как невусы Шпица, могут быть спутаны с меланомой и также давать ложноположительные результаты.

Некоторые подтипы базальноклеточного рака, такие как морфеоформный или инфильтративный варианты течения, могут представлять затруднения для обнаружения, так как тонкие нити опухолевых клеток или отдельные атипичные опухолевые клетки могут быть трудно различимы в дермальных слоях [14][40–43].

Исследование более глубоких структур кожи может быть достигнуто повышением мощности лазера, но это уже может повлечь за собой повреждение кожного покрова. Кроме этого, сам процесс исследования повреждений кожи с помощью КЛСМ занимает значительно больше времени (чем клиническая оценка или дерматоскопия), требует специального обучения и достаточного опыта для интерпретации изображений КЛСМ. Последние технологические прорывы привели к разработке новых, портативных, более практичных ручных устройств КЛСМ, которые обеспечивают быстрое получение изображений и позволяют исследовать повреждения, расположенные в менее доступных областях тела [20]. В отличие от вертикальных срезов, полученных при обычных гистологических исследованиях, КЛСМ позволяет осуществлять виртуальное сечение кожных слоев на разной глубине, в горизонтальных плоскостях. Для лучшей корреляции с результатами гистологических исследований в настоящее время усилия специалистов-онкологов совместно с инженерами направлены на разработку таких оптических устройств, которые могли бы также выполнять оптические срезы вертикальных плоскостей и затем составлять трехмерные реконструкции очагов поражения кожи [44–50]. Кроме того, КЛСМ не требует специальной обработки тканей или окраски, что обуславливает оттенки серого в изображениях, подобно рентгеновским лучам или ультразвуку [34]. Последнее значительно повышает комплаентность проведения диагностической процедуры.

Заключение

Таким образом, многочисленными исследованиями были определены основные конфокальные характеристики при изучении различных опухолевых поражений, демонстрируя хорошую корреляцию с результатами дерматоскопического и гистологического исследований. Резюмируя, хотелось бы отметить, что возможности применения конфокальной микроскопии достаточно широки, и не только в качестве неинвазивного диагностического инструмента, но и для оценки различных динамических процессов (например, изучение реакции опухоли на проведенную терапию) новообразований кожи.

Мы попытались дать подробную характеристику изображений, полученных с помощью конфокальной микроскопии при основных злокачественных новообразованиях кожи, а также обсудили возможные перспективы применения этой новой диагностической технологии в практике дерматоонкологов.